大鼠牙齒移動過程中Piezo1對壓力側牙周組織中RIP3及MLKL的影響

張嚴勻，李 易，王 賀，張 曼，張苗苗

在正畸牙齒移動過程中，壓力側的牙周膜受壓變窄，牙周膜血管破裂，出現血循環障礙，牙周組織中的細胞膜破裂，細胞死亡，出現典型的局部細胞壞死區，也稱為玻璃樣變區，這些壞死的細胞引發急性炎癥反應，募集炎癥細胞和破骨前體細胞到炎癥區域，促進破骨細胞生成，導致骨吸收[1-2]。本課題組前期實驗研究已發現壞死性凋亡是壓力側細胞死亡的方式之一[3]，抑制壞死性凋亡可下調壓力側炎性分子的水平[4]，影響破骨細胞的形成、分化，減緩正畸牙移動的速度[5]。壞死性凋亡是主要由受體相互作用蛋白1(receptor-interacting protein 1，RIP1)、受體相互作用蛋白3(receptor-interacting protein 3，RIP3)及混合譜系激酶結構域樣蛋白(mixed lineage kinase domain-like protein，MLKL)誘導的一類不依賴于caspase的細胞死亡方式，在引發細胞死亡的同時可誘導周圍組織的免疫反應和廣泛的炎癥反應[6-7]，其中RIP3和MLKL是核心調節因子，被認為是檢測壞死凋亡發生的生物標志物[8-9]，MLKL作為最終的執行蛋白，可在RIP3催化下發生磷酸化，繼而發生寡聚化，引起質膜通透性的改變，細胞內Ca2+、Na+濃度增加，K+濃度減小,質膜完整性喪失，驅動壞死性凋亡[10]。

正畸力轉化成化學信號受多種信號通路的影響，其中離子通道是牙周組織細胞信號傳導的重要途徑之一[11]。Piezo1是近年來新發現的一種機械敏感性離子通道，該通道可以響應不同形式的機械力刺激，如拉伸力、剪切應力、膜張力等，對 K+、Ca2+、Mg2+和Na+均可滲透，其中更偏向于Ca2+，在牙周組織及細胞中有豐富的表達，可有效地將物理力轉化為相應的電化學反應[12-14]。它可以被特異性的機械敏感性離子通道抑制劑蜘蛛毒素多肽(grammostola spatulata mechanotoxin 4，GsMTx4)所阻滯，靜態壓應力可以激活人牙周膜干細胞膜上的Piezo1蛋白，經靜態壓應力預處理的牙周膜細胞(periodontal ligament cells, PDLCs)與小鼠單核細胞系RAW264.7共培養中，Piezo1抑制劑抑制破骨細胞的形成[15]。已有研究證明Piezo1可被機械應力激活，增進Ca2+的內流，干擾細胞內Ca2+穩態，驅動內質網的應激系統，導致隨后的細胞凋亡[16]。然而，在施加正畸力后Piezo1是否會影響到壓力側牙周組織發生的壞死性凋亡，尚未見報道。本實驗建立大鼠牙齒移動的正畸模型，通過局部注射GsMTx4阻斷壓力側牙周組織 Pizeo1通道，檢測RIP3、MLKL表達量的變化，探討Piezo1是否影響壓力側牙周組織壞死性凋亡，為臨床正畸治療提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與構建大鼠牙移動模型

選用75只6～8周齡的雄性SD大鼠(遼寧長生生物實驗室)，體重180～200 g，隨機將其分為空白對照組(A組)，加力組(B組)，加力+抑制劑組(C組)，每組各25只。術前禁食12 h，選取左側上頜牙弓為實驗側，2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠(0.1 mL/100 g)后，在上頜的左側第一磨牙與中切牙間用結扎絲固定一段鎳鈦拉簧，將加力值設為50 g。大鼠牙移動模型構建完成后，對C組大鼠左上第一磨牙的近中牙周組織處每隔1 d注射一次GsMTx4藥液，劑量為50 μL，濃度為48 μmol/L[17](圖1)。本研究獲得哈爾濱醫科大學附屬第一醫院倫理委員會批準。

1.2 組織準備

分別于加力后 1、3、5、7、14 d采用心臟灌注的方法處死大鼠，取大鼠的左上頜磨牙及周圍組織塊，于多聚甲醛中固定48 h，EDTA脫鈣42 d后，進行脫水、包埋，沿著大鼠牙體長軸的矢狀方向進行厚度為5 um的連續切片。恒溫65 ℃烤片2 h后，進行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色和免疫組織化學染色。

1.3 牙齒移動距離測量

取大鼠的上頜兩側磨牙及周圍組織塊,由同一人員使用數字游卡尺分別測量左側和右側的第一磨牙近中齦牙連接處與中切牙遠中齦牙連接處之間的距離,右側磨牙切牙間所測得距離與左側磨牙切牙間所測得距離之差即為左側上頜第一磨牙移動的距離,每個組織進行反復測量3次,最后取平均值。

1.4 HE染色

用蘇木精染液對組織切片進行染色，時間約為5 min，鹽酸酒精對組織切片進行分化，時間約為10 s后，置于溫水中直至藍色出現，伊紅液中復染約3 min，應用中性樹膠對其進行封固處理。

1.5 免疫組化檢測壓力側RIP3、MLKL的表達

先將組織切片進行脫蠟至水、修復、封閉，然后分別滴加RIP3、MLKL一抗(1∶100稀釋)，貼膜，放置于濕盒內，冰箱4 ℃條件下孵育過夜之后滴加二抗(1∶200稀釋)，貼膜孵育后，進行顯色、復染、脫水、二甲苯透明化處理，應用中性樹膠對其進行封固處理，通過Image pro plus 6.0軟件對染色后陽性表達細胞進行平均光密度測定。

1.6 統計學分析

采用SPSS 24.0通過ANOVA檢驗對所有數據進行統計學分析，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠正畸牙移動距離的比較

A組的正畸牙齒在各個時間點均無移動，B組和C組的移動距離均隨時間而增加。其中B組牙齒移動距離在3 d內明顯增加，隨后增加相對減慢，7～14 d趨于穩定，而C組牙齒移動距離在3 d內同樣明顯增加，隨后趨于穩定，5～7 d移動距離增加相對減緩，7～14 d再次趨于穩定。與B組相比較，C組的牙齒移動距離在各時間點均明顯減小(P<0.05)，如圖2所示。

2.2 正畸加力后壓力側牙周組織變化

HE染色顯示：A組牙周膜形態較好，其纖維排列較為規律、整齊，牙槽骨的表面平整，未發現骨吸收陷窩；B組，3 d時受壓側牙周膜的寬度開始變得窄縮，其纖維排列變得紊亂，7 d時受壓側牙槽骨邊緣部位出現骨吸收陷窩，14 d時，牙周膜的寬度恢復接近于A組，未見明顯的骨吸收陷窩，牙周組織形態恢復正常(圖3)。

2.3 壓力側RIP3免疫組化染色結果

A組RIP3的表達量在各時間點均無明顯差異(P>0.05)。施加正畸力后，B組RIP3的表達量增加至5 d時達到高峰，隨后開始進行下降，在3、5 d時表達量顯著高于A組(P<0.05)。當使用GsMTx4抑制Piezo1時，C組RIP3的表達量在3、5 d時顯著低于B組，其中在5 d時C組RIP3的表達量仍高于A組，其差異有統計學意義(P<0.05)(圖4～5)。

2.4 壓力側MLKL免疫組化染色結果

A組MLKL的表達量在各時間點均無明顯差異(P>0.05)。施加正畸力后，B組MLKL表達量增加至3 d時達到高峰，隨后開始下降，在3～7 d時表達量顯著高于A組(P<0.05)。當使用GsMTx4抑制Piezo1時，C組MLKL的表達量在3～7 d時均顯著低于B組，但仍均高于A組，其差異有統計學意義(P<0.05)(圖6～7)。

3 討 論

Piezo1是一種可以對戳刺、拉伸、剪切力等各類形式的機械刺激做出反應,并具有高度機械敏感性的離子通道，該通道呈一種類似于三聚體螺旋槳狀的結構，利用杠桿原理將不同形式機械刺激傳遞到中心離子通道孔區域，使得離子通道開放，引起Na+、Ca2 +、Mg2 +等多種離子內流，誘導膜電位去極化，從而有效完成機械轉導的過程，為機體參與功能調節等多種生理過程所必需的[13,18]。Piezo1通道可被GsMTx4特異性阻斷，GsMTx4是一種從蜘蛛毒液中分離出來的富含半胱氨酸的多肽，其抑制作用類似于一種門控修改器，阻滯Piezo1的活動是通過插入通道和細胞膜脂質臨界面，并對通道施加壓縮應力使其變為關閉結構從而選擇性地阻斷該陽離子通道[17,19]。在牙齒移動期間，牙周膜細胞可以感知機械應力，在維持牙周穩態和調節牙周組織重塑方面起著至關重要的作用[20]。在本實驗發現中，與單純加力組大鼠牙齒移動距離相比，加力+抑制劑組正畸牙向近中移動的距離明顯縮短，說明注射GsMTx4后可使大鼠牙齒移動速度減慢，提示Piezo1通道可能在正畸牙齒移動過程中起著機械轉導作用，并在維持正畸牙齒速度中起著重要的調節作用。值得注意的是阻斷Piezo1通道后，牙齒移動速度變緩慢但并沒有完全停止，說明在正畸牙齒移動中，還存在其他信號轉導通道與Piezo1協同完成其機械轉導的過程。

在正畸力的作用下，牙周膜細胞通過多種生物力學信號轉導通路的調節，可將外界力學信號轉化為生物化學變化引起牙周組織代謝的改變及牙槽骨的改建，實現正畸牙齒的定向移動[21]。本課題組前期實驗已發現壞死性凋亡作為壓力側細胞壞死機制之一[3]，可下調壓力側白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-17(interleukin-17，IL-17)炎性因子的分泌水平[4]，影響破骨細胞的分化成熟，阻礙大鼠正畸牙的移動[5]。RIP3與MLKL是導致壞死性凋亡發生的兩個關鍵信號因子，RIP3與RIP1結合并相互作用，通過磷酸化的方式激活，進而招募下游分子MLKL并催化其發生磷酸化，從而觸發壞死性凋亡的生物開關，致使質膜發生破裂，其內容物大量釋放，進而誘發局部的炎癥損傷[22-23]。此外，已有研究證明RIP3促進炎性細胞因子的表達可以不依賴于壞死性凋亡通路，其在缺乏壞死性凋亡效應物MLKL的情況下，可促進Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor pyrin domain 3，NLRP3)炎癥小體的激活及IL-1β炎性因子的成熟和分泌[24]。

本實驗結果顯示，加力組壓力側RIP3與MLKL的表達量均呈先增高后下降的趨勢，不相同的地方是RIP3的表達量在3～5 d時顯著增高，而MLKL的表達量在3～7 d時顯著增高，這均與牙齒移動速度的趨勢基本相一致，提示壞死性凋亡可能參與正畸力作用之下的鼠牙壓力側牙周組織的重建，影響牙齒移動的速度。本實驗中大鼠牙齒在正畸力的作用下均在3 d內移動速度最快，其中單純加力組RIP3的表達量在3 d時顯著高于對照組，提示壞死性凋亡可能發生于正畸加力初期，并有加速壓力側牙周組織改建的作用，而使用抑制劑后，在3 d時RIP3的表達量顯著低于單純加力組并與對照組相比較無顯著差異，且正畸牙齒移動距離明顯縮短，說明GsMTx4在3 d時的抑制作用較為明顯，GsMTx4可通過抑制Piezo1通道減少RIP3的表達量并下調牙齒移動距離。此時，抑制劑組RIP3的表達量雖與對照組無顯著差異，但大鼠牙齒仍在3 d內移動最快，這些結果表明正畸牙齒的移動是一個復雜的過程，受多種因素的影響，壞死性凋亡只是影響牙齒移動的其中一個因素。加力時使用GsMTx4后，RIP3與MLKL的表達量與單純加力組在不同時間點相比較有所下降，說明抑制Piezo1通道，可下調壓力側牙周組織壞死性凋亡的發生，從而抑制破骨細胞的生成和分化，阻礙牙齒移動。然而在壞死性凋亡發生的過程中，MLKL作為RIP3的下游分子，卻與RIP3表達量變化并不完全一致，這說明RIP3可能還通過別的途徑參與和壞死性凋亡無關的其他信號通路來影響牙周組織的改建，推測RIP3在獨立于其激酶功能和底物MLKL情況下，可能通過促進caspase-8的活性來激活與NLRP3相關的caspase-1，進而調控炎性細胞因子的釋放，介導壓力側牙周組織的炎癥反應，同時也提示Piezo1抑制劑GsMTx4在不同時間點對RIP3參與的不依賴于MLKL的其他炎癥通路可能同樣起著很大程度的抑制作用，但具體途徑與機制尚不清楚，還需進一步研究。

綜上所述，本實驗通過建立大鼠牙齒移動的正畸模型，發現Piezo1通道在大鼠正畸牙齒移動過程中可能起著機械轉導的作用，阻斷Piezo1通道可減少正畸牙壓力側牙周組織壞死性凋亡的發生，影響牙周組織改建，阻礙正畸牙齒的移動，然而Piezo1影響壞死性凋亡的具體分子機制尚不清楚，仍需要結合更多的實驗進一步闡明。