幾種因素對紙莢豆不定根生長的影響研究

劉懿萱，徐亞男，金美玉，樸炫春，廉美蘭

(延邊大學 農學院，吉林 延吉 133002)

紙莢豆(Sutherlandiafrutescens(L.)R.Br.)屬豆科多年生灌木植物[1]，產于非洲南部炎熱干旱的地區，其全株富含松醇、黃酮、多糖、三萜皂苷等多種活性物質[2-4]，具有抑菌、抗氧化、抗炎、抗病毒和抗腫瘤等藥理活性，整株皆可入藥[5-7]。然而，由于人為過度采集導致紙莢豆自然種群數量不斷下降，加上種子發芽率低等原因導致紙莢豆人工栽培困難，使紙莢豆植物材料滿足不了其產品生產的需求，因此早期有學者嘗試利用生物反應器來大量培養無菌苗，但發現其玻璃化現象嚴重[8]，至今未見此培養體系為人工栽培提供優良種苗的報道。

植物不定根培養是一種可在短期內大量獲得植物材料，生產有效代謝產物的方法[9-11]。目前，此技術已在東北刺人參[12]、何首烏[13]、貫葉連翹[14]等多種藥用植物上得到了應用，但紙莢豆不定根培養的研究至今尚未見報道。植物生長調節劑對離體培養的植物細胞或器官生長起著重要的作用[15]。在不定根培養中，往往通過在培養基中添加生長調節劑來誘導不定根并提高增殖效率，且有前人研究表明，適宜濃度的吲哚丁酸(IBA)能夠有效促進植物生根發育[16-18]。碳源是植物生長發育的能源物質，而且影響著代謝產物的積累[19-20]；蔗糖相比于其他碳源物質穩定性高，價格低廉，被廣泛應用于植物組織培養中[21]。但不同植物對蔗糖濃度的要求不同[22-23]，為了提高培養效率必須對蔗糖適宜濃度進行篩選。另外，培養周期過長時，培養物因衰老，生物量和代謝物質的積累均下降，且會增加生產成本；周期過短時，因生物量不足會導致總生產量的下降，表明適宜培養周期的確定尤為重要。

綜上所述，該試驗以從紙莢豆種子獲得的無菌苗為試材，利用無菌苗根誘導不定根后，探究了IBA濃度、蔗糖濃度以及培養周期對不定根生長的影響，為今后進一步完善紙莢豆不定根培養體系提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

紙莢豆種子由韓國忠北大學白基燁教授團隊提供。

1.2 方法

1.2.1 不定根誘導

挑選生長飽滿的紙莢豆種子，用自來水沖洗干凈，利用75%乙醇消毒30 s和0.1%NaClO溶液消毒30 s，然后用無菌水沖洗4～5次，將已滅菌的種子接種至MS培養基(瓊脂8 g/L，蔗糖30 g/L，pH值5.8)中，將接種完畢的種子置于25 ℃和光照16 h條件下培養[24]。待種子萌發成嫩芽后，將其接種至生根培養基(MS+3 mg/L IBA)中，當子葉展開，胚根上長出側根時，切取側根(長約1 cm)，將其平鋪于生根培養基中暗培養。待長出不定根后，將其切分成單根，繼續接種于生根培養基中繼代增殖培養，當不定根生長30 d(根長約1 cm，呈白嫩狀態)且達到一定量時用于后續試驗。

1.2.2 試驗設計

1) IBA濃度篩選 在培養皿(φ×h=9 cm×1.5 cm)中加高溫滅菌的MS培養基(25 mL)[25]，將IBA培養濃度梯度分別設置為1、2、3、4和5 mg/L，培養基其它成分為蔗糖30 g/L和瓊脂8 g/L，pH值調節為5.8，將增殖培養30 d不定根切成約1 cm后，將9個不定根外植體接入培養皿中，在25 ℃條件下暗培養，40 d后調查不定根生根數、根長、生長狀態以及生物量。

2) 蔗糖濃度篩選 選取IBA最佳濃度(3 mg/L)作為培養條件，將蔗糖濃度梯度設置為20、30、40、50、60 g/L，培養基其他成分、操作方法以及調查指標如同1)。

3) 培養周期篩選 選取IBA最佳濃度(3 mg/L)和最佳蔗糖濃度(30 g/L)為培養條件，分別于10、20、30、40、50 d調查不定根根長、根數及生物量等相關指標，培養基其他成分和操作方法同1) 。

1.2.3 不定根根長、根數及生物量的測定

對紙莢豆不定根進行拍照后，利用Image J軟件測根長和根數[26]。為了測定不定根生物量，將收獲的不定根在流水下沖洗2～3次，利用M-3擦拭紙吸除表面水分后，稱重，記錄鮮物重(FW)。然后將不定根放在45 ℃恒溫烘干箱中烘干48 h至恒重后，稱重，得到干物重(DW)。

1.3 數據分析

培養皿試驗每個處理設置10次重復，試驗數據利用SPSS 22.0軟件用鄧肯氏新復極差法進行方差分析，顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 IBA濃度對紙莢豆不定根生長的影響

用不同濃度IBA處理后對紙莢豆不定根生長狀態進行調查的結果發現，經過一段時間的生長，接種的不定根變成紅褐色，而新長出的側根白嫩粗壯，隨著IBA濃度的增加側根數目顯著增多，在IBA 3 mg/L處理不定根長勢最好，當濃度增加至5 mg/L時紙莢豆不定根數目顯著減少，根長變短(圖1)。側根長度和數目在IBA濃度為3 mg/L時達到頂峰，平均生長出約12個側根，平均長度為11.563 mm，與其它4個處理組濃度相比，具有顯著性差異(圖2)。同時對培養40 d后的紙莢豆不定根的生物量進行測定的結果表明，在3 mg/L IBA處理下的紙莢豆不定根鮮重和干重分別達到了最大值1.162和0.076 g/vessel，優于其它4組處理的生物量(圖3)。

圖1 不同IBA濃度下增殖生長的紙莢豆不定根

圖2 IBA濃度對紙莢豆不定根根長和根數的影響 圖3 IBA濃度對紙莢豆不定根生物量的影響

2.2 蔗糖濃度對紙莢豆不定根生長的影響

經過不同蔗糖濃度處理40 d的紙莢豆不定根主根呈紅褐色且變粗變長，新生部分仍為白色，并在分支點上不斷長出側根。在蔗糖濃度為30 g/L時長勢最優，當濃度增加至50和60 g/L時，紙莢豆不定根長勢不佳，不利于不定根生長(圖4)。隨著蔗糖濃度的增加側根長和根數不斷增加，濃度為30 g/L時，達到最大值，平均生長出約13個側根，平均長度為11.565 mm，與其它4個處理組濃度相比，具有顯著性差異(圖5)。而在30 g/L蔗糖處理下的紙莢豆不定根的生物量雖優于其它處理組，但與60 g/L蔗糖處理組無顯著性差異(圖6)。

圖4 不同蔗糖濃度下增殖生長的紙莢豆不定根

圖5 蔗糖濃度對紙莢豆不定根根長和根數的影響 圖6 蔗糖濃度對紙莢豆不定根生物量的影響

2.3 培養周期對紙莢豆不定根生長的影響

不同培養周期后對紙莢豆不定根生長狀態進行調查的結果，培養10 d時可觀察到主根變長，在生長點開始分化出側根；20 d時主根顏色有變紅的趨勢，側根長度不斷增加，且在根尖處長出絨毛；在30 d時主根顏色逐漸加深，側根根尖絨毛變多且出現變色現象；培養至40 d時可觀察到側根也開始分化成新的側根；當培養至50 d時發現側根數量顯著增多；培養至60 d時，側根根部均已變成紅褐色，主根和側根發生萎蔫，水分流失，已呈衰老狀態(圖7)。紙莢豆不定根的根長隨培養時間增加總體呈現先上升的趨勢；在20～40 d時，不定根根數呈平緩上升的狀態，但培養至50 d后，側根數量急劇增加，培養至60 d側根數量無明顯變化(圖8)。且當培養周期為50 d時，不定根生物量最大，且顯著高于前4組處理，但與60 d無顯著性差異(圖9)。

圖7 不同培養周期下增殖生長的紙莢豆不定根

圖8 培養周期對紙莢豆不定根根長和根數的影響

圖9 培養周期對紙莢豆不定根生物量的影響

3 討論與結論

不定根是一類代謝途徑完善，具有與外植體相似的生產活性物質能力的器官，相較于細胞培養技術，不定根培養的代謝和活力更為穩定，是大規模生產目標產物的最佳培養方式[27-28]。例如，關倩[29]發現，利用不定根培養生產的北柴胡材料的產率、穩定性以及經濟實用性遠比愈傷組織培養和細胞培養高；李鐵軍[30]發現，植物不定根培養獲得的西洋參不定根生物量要遠高于細胞培養，同時具有比細胞培養更好的穩定性。因此，該文對紙莢豆不定根培養體系進行了探究，旨在緩解其資源短缺的問題。

不定根的生長發育依賴多種因素，植物生長調節劑的添加對其起關鍵作用[31]，而其中的IBA能誘導植物根細胞分化和分裂，從而促進不定根的形成。于曉坤等[32]人發現，當IBA濃度為1 mg/L時，貫葉連翹不定根的增殖效果最好；李潤田等[33]人發現，2 mg/L的IBA對西洋參不定根誘導效果顯著，可見IBA的添加量對不同植物生根效應也會有所差異。因而，該試驗對IBA濃度進行篩選，發現IBA濃度過低紙莢豆不定根分化緩慢，濃度過高不定根生長明顯受到抑制，當IBA濃度為3 mg/L時，紙莢豆不定根生長狀態最佳。

碳源是植物組織培養成功與否的關鍵因素，而蔗糖是植物組織培養中最常見的碳源[34]，相較于其他糖類，具有穩定性高、污染率小、價格低廉等優點，并且能夠持續維持植物細胞滲透壓從而有效促進植物生長，但不同植物在培養過程中所需要的蔗糖濃度大小可直接影響其對養分吸收的量[35]。因此，對于完整的不定根培養體系來說，篩選出最適蔗糖濃度是必要的。如郭肖紅等[36]發現，在蔗糖濃度為 60 g/L的條件下最利于丹參不定根生物量的積累；范艷敏等[37]人發現，當蔗糖濃度為30 g/L時，培養的木豆不定根鮮物重生物量高，生長狀態好，不定根的分支變多且粗壯，蔗糖濃度過高會使不定根的滲透壓升高，導致其生長狀態較差，反而不利于不定根生長，這與該試驗結果一致。

而不同的培養周期對植物的生長也至關重要。如Zhao等[38]人發現，培養三七不定根7周時，最有利于不定根的生長及生物量的積累。左北梅等[39]人探究了培養周期對人參不定根生長發育的影響，發現當培養周期為40 d時，收獲的不定根生物量達到了最大值?？梢?，不同的培養周期對植物生長以及生物量的積累也有著較大的影響。該試驗發現，培養周期過短紙莢豆不定根生長尚未完全，培養周期過長會導致不定根失水萎蔫，可能是培養基已無法提供不定根所需養分和水分而使其到達衰亡期的狀態。試驗結果說明，培養周期為50 d時，不定根達到最佳生長狀態。

綜上所述，該試驗根據紙莢豆的生長狀態、根長、根數以及生物量確定了紙莢豆不定根培養體系的最佳IBA濃度為3 mg/L，最佳蔗糖濃度為30 g/L，最佳培養周期為50 d，并且發現隨著培養周期的增加，紙莢豆不定根主根和部分側根根部顏色會有很大改變(白色變至紅褐色)，且側根尖部有白色絨毛的出現，此結果可為完善紙莢豆不定根培養體系提供理論參考。