響應面法優化超聲波輔助提取錐栗殼色素工藝研究

黃慶斌，任 俊，黃 艷

（1.福建林業職業技術學院，福建 南平 353000；2.武夷學院 茶與食品學院，福建 武夷山 354300）

錐栗（Castanea henryi Rehd.et Wils） 屬山殼斗科植物，別名毛榛、尖栗、為落葉喬木[1]。錐栗外殼亮麗，營養價值高，富含碳水化合物、蛋白質和脂肪等。據《本草綱目》記載，錐栗具有治腰腳不遂、內寒腹瀉、補腎益氣等功效。在我國，錐栗種植于閩、浙、贛、川等地，閩北建甌市被稱為“錐栗之鄉”，種植面積廣、產量高、品種齊全[2-4]。對錐栗果實的開發利用已被廣泛關注，而大部分錐栗殼被焚燒或廢棄，不僅造成資源浪費，而且極易造成環境污染[5]。錐栗殼不僅能去皺、止血，毛球具有消腫等功能，而且富含天然色素——棕色素等[6]。據統計，建甌錐栗產量達3.3萬t/年，產值超過4.61億元，錐栗殼可達1.85萬t[7]，這為錐栗殼棕色素的提取提供了原料保障。

色素分為天然色素與合成色素[8-10]，合成色素與天然色素相比著色力強、性質穩定、價格便宜等優點。研究表明，幾乎所有的合成色素都無法提供人體所需的營養素，有些合成色素的安全性受到質疑，被嚴格限制使用[11-13]。天然色素因其無副毒作用、安全性高等優點被人們所追捧，在市場上以每年保持10%以上的速度增長[14]。

在我國目前有34種色素已被批準允許在食品行業中使用。歐美發達國家非常注重對天然色素的開發和利用[15-16]。近年來，隨著經濟發展、行業標準提高，食品飲料行業對色素的需求也隨之增長，天然色素是未來色素發展的主要趨勢[17]。

超聲波提取技術（Ultrasonic extraction）是利用超聲波的機械、空化、熱效應等物理破碎方法來完成生物有效成分的提取[18]，該過程不會改變浸提物化學成分的結構和性質[19]。超聲波輔助技術在食品有效成分提取方面有廣闊的應用前景[20]。

國內科學家對錐栗栽培[21-22]、生理特性[23]、加工貯藏[24]等方面的研究較多，對錐栗殼的有效利用研究不多見。以碳酸鈉溶液為溶劑，應用超聲波輔助浸提，探究超聲時間（A）、超聲溫度（B）、超聲功率（C）、料液比等因素對錐栗殼色素提取的影響，再通過響應面法優化提取工藝參數，以期為錐栗殼天然色素開發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

錐栗殼，市售，經篩選除去霉爛，清洗晾曬至干，將貼殼帶絨毛果衣去除，然后置于60℃烘箱中24 h，再粉碎過100目篩，備用[5]。

碳酸鈉（AR），西隴化工股份有限公司提供；無水乙醇（AR），三明市三圓化學試劑有限公司提供。

DZF-6050型真空干燥箱，揚州市培英實驗儀器有限公司產品；RE52-99型旋轉蒸發儀，上海亞榮生化儀器廠產品；SartoriusBSA2245型電子分析天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司產品；HH-S4型數顯恒溫水浴鍋的，河北中捷儀器制造有限公司產品；DHF-9123型電熱恒溫鼓風千燥箱，上海精宏實驗設備有限公司產品；PW80型高速萬能粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司產品；KQ-520ODE型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司產品；UV-3200PC型紫外可見分光光度計，上海美譜達儀器有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 錐栗殼粗提色素的制備

參考陳世平[4]的方法，稍作調整，工藝如下：

錐栗殼粉→乙醇恒溫回流浸提→抽濾、離心→減壓濃縮→粗提液→加乙醇、乙酸乙酯及石油醚萃取除雜→減壓濃縮→冷凍干燥→粗提色素干品。

1.2.2 繪制標準曲線

稱取5.00 mg錐栗殼粗提色素于100 mL容量瓶中，加質量分數為2.5%的Na2CO3溶解定容，得質量濃度為0.05 mg/mL的標準溶液。分別吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL標準溶液于5支10 mL具塞試管中，依次向試管中加質量分數為2.5%的Na2CO3溶液9.0，8.0，7.0，6.0，5.0 mL定容至刻度，于最大波長277 nm處[5]測定吸光度，以質量濃度和吸光度為橫、縱坐標，繪制標準曲線。

1.2.3 提取率計算[25]

式中：C——錐栗殼色素溶液質量濃度，mg/mL；

V——錐栗提取液體積，mL；

W——錐栗殼粉質量，g。

1.2.4 單因素試驗

（1）Na2CO3溶液對錐栗殼色素提取的影響。稱取1.000 0 g錐栗殼粉6份，分別裝入6個250 mL錐形瓶中，按料液比1∶30（g∶mL）加入質量分數分別為3.0%，2.5%，2.0%，1.5%，1.0%，0.5%的Na2CO3溶液30 mL，在超聲溫度為40℃，超聲功率為450 W浸提20 min，抽濾后以轉速5 000 r/min離心15 min。取1 mL上清液稀釋至100 mL，于波長277 nm處測定吸光度。

（2）超聲功率對錐栗殼色素提取的影響。稱取1.000 0 g錐栗殼粉6份，分別裝入6個250 mL錐形瓶中，以料液比1∶30（g∶mL）加入質量分數為1%的Na2CO3溶液30 mL，于超聲溫度為40℃，分別置于超聲功率為500，450，400，350，300，250 W下浸提20 min，抽濾后操作同前文。

（3）超聲溫度對錐栗殼色素提取的影響。稱取1.000 0 g錐栗殼粉6份，分別裝入6個250 mL錐形瓶中，以料液比1∶30（g∶mL）加入質量分數為1%的Na2CO3溶液30 mL，在超聲溫度分別為80，70，60，50，40，30℃，超聲功率為450 W條件下浸提20 min，抽濾后操作同前文。

（4）超聲時間對錐栗殼色素提取的影響。稱取1.000 0 g錐栗殼粉6份，分別裝入6個250 mL錐形瓶中，以料液比1∶30（g∶mL）加入質量分數為1%的Na2CO3溶液30 mL，于超聲溫度為40℃，超聲功率為450 W條件下，分別浸提10，20，30，40，50，60 min，抽濾后操作同前文。

（5）料液比對錐栗殼色素提取的影響。稱取1.000 0 g錐栗殼粉6份，分別裝入6個250 mL錐形瓶中，在料液比分別為1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40（g∶mL）加入質量分數為1%的Na2CO3溶液30 mL，于超聲溫度為40℃，超聲功率為450 W條件下浸提20 min，抽濾后操作同前文。

（6）提取次數對錐栗殼色素提取的影響。稱取1.000 0 g錐栗殼粉6份，分別裝入6個250 mL錐形瓶中，以料液比1∶30（g∶mL）加入質量分數為1%的Na2CO3溶液30 mL，于超聲溫度為40℃，超聲功率為450 W條件下浸提20 min，分別提取1，2，3，4次，抽濾后操作同前文。

1.2.5 Box-benhnken試驗設計

選取提取次數1次、Na2CO3質量分數2.5%，料液比1∶30，以錐栗殼色素提取率為響應值，以A、B、C為自變量，優化Box-behnken試驗設計，試驗重復3次以上。

因素與水平設計見表1。

表1 因素與水平設計

1.2.6 驗證試驗

將響應曲面軟件回歸模型預測值與驗證試驗結果比較，考查其擬合度，確定模型的可靠性和實際意義。

1.2.7 數據處理

單因素圖用Excel 2013繪制，采用Design Expert 8.0.6軟件建立回歸模型、繪制響應曲面圖并進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

錐栗殼色素標準曲線見圖1。

圖1 錐栗殼色素標準曲線

以質量濃度、吸光度為橫、縱坐標，得回歸方程：

式中：A——吸光度；

C——色素質量濃度，mg/mL。

由圖1可知，錐栗殼色素質量濃度為0.005～0.025 mg/mL時，吸光度與質量濃度線性關系良好。

2.2 單因素試驗結果

2.2.1 Na2CO3溶液對錐栗殼色素提取的影響

Na2CO3溶液對錐栗殼色素提取的影響見圖2。

圖2 Na2CO3溶液對錐栗殼色素提取的影響

由圖2可知，Na2CO3溶液質量分數較低時，提取率與Na2CO3溶液呈正相關，當質量分數為2.5%時，提取率為14.18%，為最大值；之后隨質量分數增加，色素提取率有所下降，可能過高的Na2CO3溶液質量分數對色素結構有一定的破壞[26]。因此，選取Na2CO3為2.5%開展下一步試驗。

2.2.2 超聲功率對錐栗殼色素提取的影響

超聲功率對錐栗殼色素提取的影響見圖3。

圖3 超聲功率對錐栗殼色素提取的影響

由圖3可知，超聲功率小于450 W時，提取率與超聲功率呈正比；當超聲功率為450 W時，提取率達到32.15%，為最大；超聲功率大于450 W時，提取率隨超聲功率的增大而降低，可能是較強的熱效應使色素加快分解，致使提取率下降[27]。因此，選取超聲功率為450 W開展下一步試驗。

2.2.3 超聲溫度對錐栗殼色素提取的影響

超聲溫度對錐栗殼色素提取的影響見圖4。

圖4 超聲溫度對錐栗殼色素提取的影響

由圖4可知，提取率隨超聲溫度的升高而提高，當超聲溫度為80℃時，提取率最大，為37.07%。超聲溫度繼續升高提取率下降，可能是到一定溫度時色素分子降解加快，使其提取率降低[27]。因此，選取超聲溫度80℃開展下一步試驗。

2.2.4 超聲時間對錐栗殼色素提取的影響

超聲時間對錐栗殼色素提取的影響見圖5。

由圖5可知，提取率與超聲時間的關系是先呈正相關而后呈負相關，當超聲時間40 min時，提取率最大，為38.47%。超聲時間繼續增加，其空化效應增強可能會破壞部分色素結構，使其提取率降低[28]。因此，超聲時間40 min為最佳。

圖5 超聲時間對錐栗殼色素提取的影響

2.2.5 料液比對錐栗殼色素提取的影響

料液比對錐栗殼色素提取的影響見圖6。

圖6 料液比對錐栗殼色素提取的影響

由圖6可知，當料液比達1∶30（g∶mL）時，提取率最大，為38.66%，之后提取率趨于平穩；可能是料液比增加提取液在色素細胞內的擴散增強，但提取液濃度低于一定程度時，滲透壓變大，擴散能力反而降低[29]。為節約耗材、降低成本，宜選用料液比1∶30（g∶mL）。

2.2.6 提取次數對錐栗殼色素提取的影響

提取次數對錐栗殼色素效果的影響見圖7。

圖7 提取次數對錐栗殼色素效果的影響

由圖7可知，錐栗殼色素提取率隨著提取次數的增加而呈上升趨勢，但上升不明顯。為提高效益，選用1次提取。

2.3 響應面試驗結果

2.3.1 建立回歸模型響應面試驗設計及結果見表2。

利用Design Expert 8.0.6軟件對表2中的響應面值開展回歸分析，得錐栗殼色素提取率與A、B、C的二項多元回歸方程為：

表2 響應面試驗設計及結果

2.3.2 方差分析

二項多元回歸方程的方差分析見表3。

表3 二項多元回歸方程的方差分析

由表3可知，模型F值為2 347.59（p＜0.000 1），說明該模型有極顯著差異；失擬項p=0.072 1＞0.05，說明無顯著差異、誤差小，擬合度高；R2=0.971 2，表明97.12%的響應值變化能夠用該模型解釋，該模型不能解釋剩余2.88%的變異值。各因素對錐栗殼色素提取效果影響程度為A＞B＞C，即超聲時間＞超聲溫度＞超聲功率。表4顯著性可知，A、A2，B2，C、C2均有極顯著影響（p＜0.000 1），交互項AC、BC這2個因素有顯著影響（p＜0.05），其他因素無顯著影響（p＞0.05）。

2.3.3 錐栗殼色素提取率響應曲面

經Design Expert 8.0.6軟件分析，圖8～圖10為試驗所得響應面圖。

超聲時間和超聲功率的交互作用對錐栗殼色素提取的影響見圖8。

圖8 超聲時間和超聲功率的交互作用對錐栗殼色素提取的影響

由圖8可知，A和C的交互作用的等高線圖為橢圓形，說明AC交互作用對錐栗殼色素提取率有顯著影響。當超聲功率固定時，色素提取率隨超聲時間的延長，呈先增后減的趨勢，提取率達最大值出現在40 min時。

超聲溫度和超聲功率的交互作用對錐栗殼色素提取的影響見圖9。

圖9 超聲溫度和超聲功率的交互作用對錐栗殼色素提取的影響

由圖9可知，B與C交互作用的等高線圖為橢圓形，表明BC交互作用對錐栗殼色素的提取率有顯著影響。當超聲溫度一定時，色素提取率隨超聲功率的增加呈先增后降的趨勢，最大值出現在超聲功率為450 W時。

超聲時間和超聲溫度的交互作用對錐栗殼色素提取的影響見圖10。

圖10 超聲時間和超聲溫度的交互作用對錐栗殼色素提取的影響

由圖10可知，AB交互作用等高線圖為橢圓形，說明AB交互作用對錐栗殼色素提取率有顯著影響。超聲溫度達到80℃時，提取率最大，之后隨超聲溫度和超聲時間增加，提取率均呈下降。

2.4 參數優化及驗證

對試驗數據用Design Expert 8.0.6軟件進行優化，得超聲波輔助Na2CO3溶液提取錐栗殼色素的最佳工藝參數為超聲時間47.1 min，超聲溫度81.38℃，超聲功率445 W，理論提取率為39.177 9%。為優化工藝參數操作性，修正為超聲時間47 min，超聲溫度81℃，超聲功率450 W，用修正后的參數做驗證試驗，測得提取率為38.41%，兩者相對誤差約為0.77%。由此表明，試驗優化的方程具有實踐意義，利用該數學模型對優化錐栗殼色素提取工藝是可行的。

3 結論

利用Design Expert 8.0.6軟件中Box-behnken功能，設計超聲時間、超聲溫度、超聲功率與錐栗殼色素提取率之間的數學模型為：

相關系數R2=0.971 2，p=0.072 1，說明數學模型顯著，擬合度高。

利用該模型的響應面，討論了影響錐栗殼色素提取率的關鍵因素及其相互作用，優化得出最佳工藝參數為超聲時間47.2 min，超聲溫度81.39℃，超聲功率450 W，此工藝條件理論預測值（39.18%）與修正工藝后的驗證結果（38.41%）間的相對誤差約為0.77%，說明該模型合理，對指導實踐有一定作用。