寧肺活血利水方對慢性阻塞性肺疾病合并肺動脈高壓外周血內皮祖細胞計數及功能影響的臨床及實驗研究

冷報浪 張云霞 趙娜 王海燕 馮霞

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以持續氣流受限為特征的肺部疾病,慢性炎癥可導致肺實質破壞和肺血管的異常而形成肺動脈高壓。肺動脈高壓是COPD 的重要并發癥之一,是 COPD 病程發展為肺源性心臟病(肺心病)的關鍵環節,嚴重影響COPD 患者的生存質量及預后［1］。如能早期有效地控制肺動脈高壓,對提高COPD 患者的生存質量,改善預后,防止肺心病的發生具有重要意義。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是內皮細胞的前體細胞［2］,EPCs 在COPD 合并肺動脈高壓形成過程中起著重要的作用,研究顯示中藥治療可以有效改善EPCs 功能,從而有效地治療COPD 合并肺動脈高壓［3］。因此,本研究應用寧肺活血利水方治療COPD 合并肺動脈高壓患者取得較好療效,并研究對外周血EPCs 數量及功能的影響,進一步通過動物實驗探討相關機制,現報告如下。

1 臨床研究

1.1 資料與方法

1.1.1 一般資料 選取2018 年11 月～2021 年11 月本院呼吸內科接治的門診或住院的60 例COPD 合并肺動脈高壓患者,所有病例符合C0PD 合并肺動脈高壓的診斷標準［4,5］,且為急性發作期［6］。采用隨機數字表法將患者分成對照組和研究組,各30 例。

1.1.2 治療方法 對照組參照COPD 診治規范［4］采用常規抗感染、止咳、化痰、平喘及對癥治療。研究組在對照組的基礎上口服寧肺活血利水方,方藥組成：桑白皮10 g、澤蘭10 g、浙貝母10 g、葶藶子6 g、法半夏10 g、丹參20 g、瓜蔞皮15 g、廣郁金10 g。水煎服,1 劑/d。兩組均不得使用其他血管活性藥物,療程均為4 周。

1.1.3 觀察指標及判定標準 比較兩組治療前后中醫證候積分、肺動脈壓、外周血EPCs 計數及功能、臨床治療效果。

1.1.3.1 EPCs 計數及功能 在無菌條件下清晨抽取患者空腹狀態下的肘靜脈血15 ml,使用肝素抗凝并輕輕混勻,4 h 內離心分離血清,分裝后保存于-80℃冰箱,標本收集完成后統一進行實驗研究。參照文獻方法［7,8］對標本進行EPCs 分離、培養鑒定及計數,以淋巴分離液經密度梯度離心法獲得單個核細胞,進行體外培養,免疫熒光法鑒定雙熒光陽性細胞得到EPCs,最后應用流式細胞儀計數每10 萬個單個核細胞中CD34+VEGFR-2+CD45-的EPCs 所占的比例。按實驗步驟,在 EPCs 中加入 LCCK-8 溶液培養,酶標儀測定在450 nm 處的吸光度,測定EPCs 增殖能力；用胰蛋白酶消化液、PBS 洗脫后,計數貼壁細胞,測定EPCs 粘附能力；用胰蛋白酶消化液、EBM-2 培養后,計數遷移到底層的細胞數,測定EPCs 遷移能力。

1.1.3.2 中醫證候積分、肺動脈壓 參照《中醫內科病證診斷療效標準》［9］對患者的癥狀、體征等進行評分,主要包括咳嗽、咳痰、胸悶、喘憋、氣短、乏力、心悸、哮鳴音、睡眠等,每項0～3 分,0 分為無癥狀；1 分為輕微；2 分為較明顯能忍受,但不影響生活；3 分為顯著并影響生活。采用多普勒超聲心動圖法測定患者肺動脈壓的變化。

1.1.3.3 療效判定標準［10］通過尼莫地平法,根據治療前后肺動脈壓變化情況進行療效評價：控制：癥狀、體征基本消失,中醫證候積分下降≥95%,且肺動脈壓恢復到正常水平；顯效：癥狀、體征有顯著改善,70%≤中醫證候積分下降<95%,肺動脈壓降低>15%；有效：癥狀、體征有所緩解,30%≤中醫證候積分下降<70%,肺動脈壓降低5%～15%；無效：癥狀、體征無顯著改善,未達到上述標準?？傆行?(控制+顯效+有效)/總例數×100%。

1.1.4 統計學方法 采用SPSS18.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,采用t 檢驗；計數資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

1.2 結果

1.2.1 兩組患者治療前后中醫證候積分、肺動脈壓比較 治療前,兩組患者中醫證候積分、肺動脈壓比較,差異無統計學意義(P>0.05)；治療后,兩組中醫證候積分、肺動脈壓均較治療前降低,且研究組顯著低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 兩組患者治療前后中醫證候積分、肺動脈壓比較 ()

表1 兩組患者治療前后中醫證候積分、肺動脈壓比較 ()

注：與本組治療前比較,aP<0.05；與對照組治療后比較,bP<0.05

1.2.2 兩組患者治療前后外周血EPCs 計數及功能比較 治療前,兩組患者EPCs 計數、EPCs 增殖能力、EPCs 遷移能力、EPCs 粘附能力比較,差異無統計學意義(P>0.05)；治療后,兩組EPCs 計數、EPCs 增殖能力、EPCs 遷移能力、EPCs 粘附能力均較治療前升高,且研究組高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 兩組患者治療前后外周血EPCs 計數及功能比較()

表2 兩組患者治療前后外周血EPCs 計數及功能比較()

注：與本組治療前比較,aP<0.05；與對照組治療后比較,bP<0.05

1.2.3 兩組患者臨床治療效果比較 研究組的治療總有效率為93.33%,明顯高于對照組的73.33%,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 兩組患者臨床治療效果比較 (n,%)

2 動物實驗

2.1 材料與方法

2.1.1 材料 收集30 只8周齡的雄性SD 大鼠,體質量150～200 g。適應性飼養2周。隨機分為模型組、干預組及空白對照組,每組10 只。

2.1.2 方法 先進行動物造模,模型組及干預組于項背部皮下注射 1%的野百合堿(monocrotaline,美國Sigma 公司)50 mg/kg,以誘導形成肺動脈高壓模型;空白對照組注射等量PBS。注射當天為第0 天。干預組于第3 天開始予以寧肺活血利水方水煎液20 ml/kg灌胃,寧肺活血利水方方藥組成同臨床研究,由醫院中藥房自動煎藥機煎煮成水煎液,每劑中藥劑量煎成150 ml×2 袋；模型組以等量蒸餾水灌胃,總共21 d。第21 天三組大鼠經尾靜脈取血,進行循環EPCs 含量測定,并分別采用EPCs 體外培養8 d 進行相對增殖能力檢測、用PBS 洗脫法進行相對粘附能力檢測、用單層細胞法進行相對遷移能力檢測［11］。經靜脈采血后的大鼠以10%水合氯醛(3 ml/kg)腹腔注射麻醉,自右側頸外靜脈插管至右心室,應用PM-8000 型多參數監護儀測定RVSP,以此間接反映肺動脈壓［12］。

2.1.3 統計學方法 采用SPSS18.0 統計學軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差()表示,采用t 檢驗。P<0.05 表示差異具有統計學意義。

2.2 實驗結果 空白對照組RVSP 低于模型組及干預組,EPCs 計數、EPCs 增殖數、EPCs 粘附能力、EPCs 遷移能力高于模型組及干預組,差異有統計學意義(P<0.05) ；干預組RVSP 低于模型組,EPCs 計數、EPCs 增殖數、EPCs 粘附能力、EPCs 遷移能力高于模型組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 三組大鼠RVSP、靜脈血中EPCs 計數及功能比較()

表4 三組大鼠RVSP、靜脈血中EPCs 計數及功能比較()

注：與空白對照組比較,aP<0.05；與模型組比較,bP<0.05

3 討論

COPD 由于反復發作常致伴發肺動脈高壓,而肺動脈高壓是COPD 向肺心病發展的中心環節。治療上降低肺動脈壓和肺血管阻力有積極意義,但血管擴張劑由于選擇性差使臨床應用受限,雖然有新的藥物與療法的開發和應用使得肺動脈高壓的臨床癥狀能夠在一定程度上得到改善,但遠期預后依舊不佳,且在COPD合并肺動脈高壓患者,中作用未得到證實［13］。國內中西醫結合的研究顯示,中醫藥有較好的降肺動脈壓作用。祖國醫學認為COPD 可按咳嗽、喘證、哮證、痰飲、肺脹、胸痹等范疇辨證論治,其病因病機復雜,特別是COPD 發展到肺動脈高壓階段由于病情反復發作,病機錯綜和病理因素復雜及相互影響和轉化,其痰濁久留,肺氣郁滯,心脈失暢,瘀阻血脈,“血不利則為水”,終至痰、血、水錯雜為患?！胺S證立、方從法出”,故確立了復法合方辨治手段,應用寧肺活血利水方治療COPD 合并肺動脈高壓患者,該方由桑白皮、葶藶子、浙貝母、法半夏、澤蘭、丹參、瓜蔞皮及廣郁金等組成。全方具有寧肺活血利水之功,又具化痰瀉肺平喘之效,可達氣血水諸證兼顧之能。本文前期研究結果顯示［14］,該方對治療COPD 合并肺動脈高壓患者有較好的臨床療效,本課題進一步研究了該方治療COPD 合并肺動脈高壓患者的療效,并研究對外周血EPCs 數量及功能的影響,同時,通過動物實驗探討相關機制。

本研究結果顯示,研究組患者在常規對癥治療基礎上加用寧肺活血利水方,治療4 周。治療后研究組患者中醫證候積分顯著低于對照組,差異具有統計學意義(P<0.05),與相關研究報道基本一致［15］。由此看出,寧肺活血利水方有助于改善COPD 合并肺動脈高壓患者的癥狀。同時,治療后,兩組肺動脈壓均較治療前降低,且研究組顯著低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。提示在常規西藥治療基礎上服用中藥寧肺活血利水方,能有效降低肺動脈壓,進而改善心肺功能,顯示了中西醫結合在COPD 合并肺動脈高壓治療中的臨床價值。

在COPD 的反復發作過程中,由于肺血管內皮細胞的損傷并呈進行性加重,導致肺動脈高壓以及肺心病,研究顯示血管祖細胞參與內膜增生的發病機制主要通過血管內皮生長因子(VEGF)相關信號［16］。內皮細胞受到各種病理因素刺激損傷后會逐漸導致血管內皮功能障礙。EPCs 是內皮細胞的前體細胞,研究發現COPD 患者的長期缺氧狀態以及炎癥因子刺激可導致外周血EPCs 數量減少和功能受損,在COPD 肺動脈高壓形成過程中起著重要的作用［17］。因此,改善COPD 患者外周血的EPCs 計數及功能,可以保護并修復COPD 患者的血管內皮功能,改善肺動脈高壓,對于COPD 合并肺動高壓的防治具有重要意義。既往的研究顯示［18］,在體外試驗中具有活血化瘀作用的姜黃素可增加COPD 患者外周血EPCs 計數,并改善EPCs 增殖功能。

在本課題臨床研究中發現,治療后,兩組EPCs 計數、EPCs 增殖能力、EPCs 遷移能力、EPCs 粘附能力均較治療前升高,且研究組高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。顯示寧肺活血利水方在有效降低肺動脈壓的同時,能增加 COPD 合并肺動脈高壓患者外周血EPCs 計數,并明顯改善EPCs 增殖能力、遷移能力、粘附能力。在動物實驗中,經野百合堿造模的肺動脈高壓大鼠予以寧肺活血利水方水煎液灌胃治療后,干預組RVSP 低于模型組,差異有統計學意義(P<0.05)?？陀^地證實了寧肺活血利水方能有效降低肺動脈壓。同時發現,大鼠尾靜脈血循環EPCs 含量增加,對分離的EPCs 分別進行增殖能力、遷移能力、粘附能力檢測,結果顯示,干預組EPCs 計數、EPCs 增殖數、EPCs 粘附能力、EPCs 遷移能力高于模型組,差異有統計學意義(P<0.05)。

綜上所述,在常規對癥治療基礎上加用寧肺活血利水方能有效提高COPD 合并肺動脈高壓患者的臨床療效,能明顯降低肺動脈壓,進而改善心肺功能；能夠有效增加外周血EPCs 計數,明顯改善EPCs 增殖能力、遷移能力、粘附能力,這可能是寧肺活血利水方有效降低肺動脈壓的一個重要機制。