夜光藻配子細胞實時熒光定量PCR 檢測方法的建立與應用*

張櫻馨 宋書群 李才文

(1. 中國科學院海洋研究所 中國科學院海洋生態與環境科學重點實驗室 山東青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生態與環境科學功能實驗室 山東青島 266237; 3. 中國科學院大學 北京 100049; 4. 中國科學院海洋大科學研究中心 山東青島 266071)

夜光藻(Noctiluca scintillans)是我國重要的赤潮生物, 在近海海域廣泛分布(Harrisonet al, 2011)。1992～2020 年間, 《中國海洋災害公報》共報道了28次面積超過100 km2的夜光藻赤潮, 單次赤潮最大面積達到4 000 km2。赤潮期間, 暴發性增殖的夜光藻細胞引起海水變紅, 并堵塞魚、蝦、貝類等經濟水產生物的呼吸器官, 導致其大量窒息死亡(Huanget al,1997; Shunmugarajet al, 2020); 赤潮消亡過程會過度消耗溶解氧, 并釋放胞內積累的銨、硫化氫等有毒物質(岡市友利等, 1976; Huanget al, 1997; Smayda,1997; Baliarsinghet al, 2016), 對生態系統造成極大的危害。

夜光藻可以通過二分裂的方式進行無性繁殖(杞桑等, 1994; 周成旭等, 1994), 也可通過配子結合形成合子的方式進行有性繁殖(Elbr?chteret al, 1998;宋書群等, 2016)。隨著研究的不斷深入, 發現有性繁殖可能在夜光藻種群增長中發揮重要作用(Fukudaet al, 2006)。研究自然水體中夜光藻配子細胞的豐度及其時空分布特征對了解夜光藻的有性繁殖過程, 明確其種群增長模式及控制因素具有重要意義, 將有助于夜光藻赤潮的預警、預測和防治。然而, 夜光藻配子細胞較為脆弱, 不易長期保存, 且直徑僅有10～15 μm, 形態類似裸甲藻, 在光學顯微鏡下不易鑒別(Elbr?chteret al, 1998; Fukudaet al, 2006), 因此難以通過鏡檢進行準確的定量分析。

近年來, 實時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)技術被廣泛用于海洋藻類的定量檢測,目前已經在銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)、米氏凱倫藻(Karenia mikimotoi) 、 多環馬格里夫藻(Margalefidinium polykrikoides) 、 圓 海 鏈 藻(Thalassiosira rotula)等微藻及石莼屬(Ulva)、萱藻屬(Scytosiphon)等大型藻的生殖細胞中實現了應用(Heet al, 2007; Yuanet al, 2012; 徐恒省等, 2013; 繆棟等,2018; Huet al, 2022)。與傳統的鏡檢方法相比,qRT-PCR 技術具有樣品易保存, 檢測耗時少、特異性強、靈敏度高等優勢, 非常適用于大面調查或長期監測。核糖體RNA (ribosomal RNA, rRNA)基因具有高拷貝數, Godhe 等(2008)估算9 種甲藻的拷貝數在9×105～100×105之間, 基于 rRNA 基因序列設計的qRT-PCR 引物的檢測下限可以低至個位數細胞(Yuanet al, 2012; 高巖等, 2013)。其中核糖體內轉錄間隔區(internal transcribed spacer, ITS)是常用的分子標記之一, 在rRNA 基因中有更快的進化速度, 具有豐富的遺傳變異信息?；诖诵蛄性O計的引物具有種特異性,能區分同一屬內的不同物種(Blomsteret al, 2000;Yuanet al, 2012)。

本研究設計了一對靶區域為夜光藻18S-ITS1 的物種特異性引物, 建立了qRT-PCR 定量檢測水體中夜光藻配子細胞的方法, 并應用于2015 年膠州灣逐月調查, 研究了夜光藻配子細胞和營養細胞的月度動態, 以評估本方法檢測環境樣品的可靠性和效果,為深入研究夜光藻有性繁殖及其在種群增長中的作用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 夜光藻的培養及配子基因組DNA 的獲取

實驗所用夜光藻通過垂直拖曳淺水II 型浮游生物網(網口面積: 0.08 m2, 網長: 140 cm, 孔徑: 160 μm)的方式采自膠州灣, 經分離、純化后, 培養于經0.22 μm混合纖維膜過濾的滅菌海水中, 每兩天投喂一次青島大扁藻(Tetraselmis helgolandicavar. tsingtaoensis)至餌料終濃度不低于 1×104cells/mL, 培養溫度(20.0±0.5) °C, 平均光照強度55.0 μmol/(m2·s), 光暗比為14h : 10h。

配子母細胞的識別及其發育階段的判斷參考Fukuda 等(2006)。使用毛細管挑取即將釋放配子的母細胞, 并在滅菌海水中沖洗三次以去除餌料藻, 在×200 倍下鏡檢確認沒有餌料藻殘留后, 將其轉移至2 mL EP 管中孵育24 h。孵育完成后, 先取500 μL 含有配子細胞的水樣, 加入魯哥氏液固定(終濃度1%),迅速在×200 倍下鏡檢計數; 剩余水樣濾至3 μm 孔徑的核孔濾膜上(Millipore, USA), 以收集夜光藻配子細胞。使用 DNeasy PowerSoil 試劑盒(QIAGEN,Germany)提取配子細胞的基因組DNA。

1.2 引物設計與特異性驗證

基于 GeneBank 中已知夜光藻 rRNA 基因的18S-ITS1 序列信息(GQ380592.1), 使用 Primer Premier 5.0 軟件設計, 經比對篩選, 獲得了一對擴增產物為167 bp 的引物(表1)。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 基于夜光藻18S rDNA 和ITS1 區域設計的qRT-PCR 正、反向引物Tab.1 Forward and reverse primers designed for qRT-PCR assay of N. scintillans 18S rDNA and ITS1 region

用于引物特異性驗證的11 種海洋微藻來自中國科學院海洋研究所海洋生態與環境科學重點實驗室藻種庫, 于指數生長期各取50 mL 藻液, 濾至3 μm孔徑的核孔濾膜上(Millipore, USA), 使用 DNeasy PowerSoil 試劑盒提取其基因組DNA。以夜光藻配子基因組DNA 為陽性對照, 無菌去離子水為陰性對照,采用Labcycler PCR 儀(SensoQuest, Germany)對11 種微藻的基因組DNA 進行PCR 擴增(表2), 實驗設置兩個平行。反應體系為2×PCR Mix 10 μL (東盛生物,中國), 正反向引物(10 μmol/L)各0.8 μL, DNA 模板1 μL, 無菌去離子水補足至20 μL。擴增程序為95 °C預變性5 min; 95 °C 變性30 s, 60 °C 退火30 s, 72 °C延伸30 s, 共38 個循環; 72 °C 終延伸10 min。產物經瓊脂糖凝膠(重量體積比1.2%)電泳, 使用Azure 200 凝膠成像系統(Azure Biosystems, Inc., USA), 于365 nm 波長紫外線下成像。

表2 實驗中用于qRT-PCR 引物特異性驗證的微藻Tab.2 Microalgal species used for specific test of qRT-PCR primer design

1.3 qRT-PCR 擴增與檢測

采用Rotor-Gene Q 實時熒光定量PCR 分析儀(QIAGEN, Germany)進行兩步法qRT-PCR 反應, 反應體系為SYBR Premix Ex Taq II (2×) (TaKaRa, Japan)10 μL, 正反向引物(10 μmol/L)各1 μL, DNA 模板1 μL, 無菌去離子水補足至20 μL。qRT-PCR 程序為95 °C 預變性30 s; 95 °C 變性5 s, 60 °C 退火30 s, 共40 個循環; 反應結束后在50 °C 預熔解90 s, 自50 °C至99 °C 以0.2 °C/s 的熔解速率進行熔解曲線分析。

1.4 標準工作曲線的建立與驗證

以1.1 節所述方法獲得10000 個夜光藻配子細胞的基因組DNA 并洗脫為30 μL, 使用洗脫液稀釋2、10、20、100、200、1 000、2 000、10 000、100 000倍, 各取1 μL 進行qRT-PCR 分析, 實驗設置三個平行。所得定量循環值(quantification cycle,Cq)與每反應細胞數的對數值通過線性回歸擬合為細胞數標準曲線, 以線性響應的最低細胞數代表其檢出限。

依據1.2 節所述方法, 以夜光藻配子細胞基因組DNA 為模板進行 PCR 擴增, 使用 E.Z.N.A?Gel Extraction Kit 膠回收試劑盒(OMEGA, USA)回收長度在 100～250 bp 間的目的條帶。膠回收產物連接pMD18-T 載體(TaKaRa), 轉化大腸桿菌DH5α 感受態細胞(TaKaRa), 涂布于每100 mL 含有48 μL IPTG(50 mg/mL)、200 μL X-Gal (20 mg/mL)和100 μL 氨芐青霉素(100 mg/mL)的LB 平板上。挑取白色單菌落進行菌落PCR 驗證, 選取陽性克隆擴大培養并測序,BLAST 對比確認是否為目的片段。使用E.Z.N.A?Plasmid Mini Kit I 質粒提取試劑盒(OMEGA)提取含有目的片段的質粒, 質粒經十倍梯度稀釋為100～109copies/μL 后, 取1 μL 進行qRT-PCR 分析, 實驗設置三個平行。所得Cq值與每反應拷貝數的對數值通過線性回歸擬合為標準曲線, 以線性響應的最低拷貝數代表其檢出限。

實驗用天然海水采集自膠州灣, 經20 μm 篩絹過濾處理, 且 qRT-PCR 檢驗無夜光藻配子細胞存在(Cq=35.43±0.17)。將10 000、1 000、100 個配子細胞分別接種至100 mL 海水中, 抽濾至3 μm 孔徑的核孔濾膜上, 提取其基因組DNA 并洗脫為30 μL。各取1 μL 進行qRT-PCR 分析, 實驗設置三個平行。

1.5 膠州灣現場調查

1.5.1 航次信息 于2015 年1 月至12 月, 搭載中國科學院海洋研究所“創新”號在膠州灣開展月度調查, 通常在每月上旬進行, 持續2～3 天。在調查海域布設12 個站位(圖1), 其中A3、A5、B2、C1、C4站位于灣內近岸, C3 站位于灣中心, D1、D3、D5 站位于灣口, D6、D7、D8 站位于灣外, 每個站位的水深示于表3。

表3 各調查站位水深Tab.3 Depths of sampling stations

圖1 膠州灣調查站位Fig.1 Deployment of stations in Jiaozhou Bay

1.5.2 樣品采集與處理 夜光藻營養細胞: 通過由底至表垂直拖拽淺水II 型浮游生物網采集夜光藻營養細胞, 置于廣口塑料瓶中, 加入中性福爾馬林溶液固定(終濃度5%)。將樣品濃縮定容至50 mL, 取10 mL 子樣品置于體式顯微鏡(SZ61, Olympus, Japan)下進行鑒定和計數。夜光藻配子細胞: 使用Niskin 采水器采集表層、中層和底層海水。每層取500 mL 海水, 先用200 μm 孔徑篩絹濾去中型浮游動物和夜光藻營養細胞, 再用20 μm 篩絹濾去小型浮游動物和較大的浮游植物, 最后抽濾至3 μm 孔徑的核孔濾膜上,并立即液氮保存。對濾膜進行預破碎處理后, 采用DNeasy PowerSoil 試劑盒提取樣品中的DNA。隨機挑取 3 份環境 DNA 樣品進行 PCR 擴增, 回收100～250 bp間的條帶并測序, BLAST 對比確認是否為目的片段, 實驗設置三個平行。依據1.3 節所述方法,對所有DNA 樣品進行qRT-PCR 檢測。

1.6 數據分析

qRT-PCR 擴增效率(E)與標準曲線斜率(s)的關系為:

夜光藻配子細胞的水柱平均豐度通過梯形法計算, 將配子豐度的垂直分布視為深度的函數, 對各水層的豐度進行積分后再除以水深得來。使用 SPSS 19.0 軟件對配子細胞和營養細胞豐度進行t-test、Kruskal-Wallis One-Way ANOVA、Mann-WhitneyUtest、Spearman 秩相關分析, 顯著性水平P均設為0.05。標準工作曲線的擬合, 配子細胞和營養細胞豐度月度變化圖及其他柱形圖、箱線圖均采用Origin 2019b 軟件繪制; 站位圖采用Golden Software Surfer 17.0 軟件繪制。

2 結果

2.1 qRT-PCR 方法引物特異性的驗證

使用本研究設計的引物對夜光藻配子及其他11種海洋微藻的基因組DNA 進行PCR 擴增。如圖2 所示, 僅在夜光藻配子DNA 樣品中擴增到了長度在100～250 bp 間的片段, 對片段進行測序并與目的序列進行BLAST 對比發現, 相似性達到100%; 在其他微藻DNA 樣品中均未出現擴增產物。

圖2 應用qRT-PCR 引物對不同微藻基因組DNA 擴增產物的電泳分析Fig.2 Electrophoresis analysis of the amplified products of different microalgal species using a primer pair designed for the qRT-PCR assay

2.2 qRT-PCR 方法的標準工作曲線與驗證

以梯度稀釋細胞的DNA 為模板進行qRT-PCR 分析, 熔解曲線在86.3～86.7 °C 顯示單峰(圖3a)。以Cq值為縱坐標, 細胞數的對數值為橫坐標, 通過線性回歸擬合為細胞數標準工作曲線。如圖4a 所示, 以稀釋倍數2 000, 即每反應0.17 個細胞為節點, 更低的稀釋倍數與Cq值不再具有線性關系, 將該值視為qRT-PCR 方法可檢出的最低細胞數, 回歸方程為y=－3.4373x+29.045 8, 回歸系數R2=0.993 7, 擴增效率為95.40%。

以梯度稀釋的質粒DNA 為模板進行qRT-PCR 分析, 熔解曲線同上(圖3b)。以Cq值為縱坐標, 拷貝數的對數值為橫坐標, 通過線性回歸擬合為拷貝數標準工作曲線。如圖4b 所示, 當每反應的質?？截悢蹈哂?02時, 其對數值與Cq值呈良好的線性關系, 回歸方程為y=－3.441 6x+37.979 2, 回歸系數R2=0.999 6,擴增效率為95.23%。

圖3 qRT-PCR 方法的熔解曲線分析Fig.3 Curves of melting in the qRT-PCR assay

圖4 qRT-PCR 方法標準工作曲線Fig.4 Standard curves of the qRT-PCR assay

qRT-PCR 方法的驗證如表4 所示, 接種至天然海水中的10 000、1 000、100 個夜光藻配子細胞的計算值與實際值無顯著性差異(n=6,P=0.085, 0.838, 0.150,t-test)。

表4 qRT-PCR 方法的驗證Tab.4 validation of the qRT-PCR assay

2.3 應用qRT-PCR 定量檢測膠州灣的夜光藻配子

采用本研究設計的引物對隨機挑選的3 個膠州灣環境DNA 樣品進行PCR 擴增與qRT-PCR 分析, 每組實驗均只在100～250 bp 間檢測到擴增的PCR 產物(圖5)。對產物進行回收測序并與目的序列進行BLAST對比, 序列相似性達到100 %, 且qRT-PCR 熔解曲線同樣在86.3～86.7 °C顯示單峰(圖3c), 說明該引物能夠在環境DNA 樣品中特異性地擴增目的片段。

圖5 應用qRT-PCR 引物對2015 年膠州灣環境DNA 樣品擴增產物的電泳分析Fig.5 Electrophoresis analysis of the amplified products of environmental samples in Jiaozhou Bay, 2015

應用本方法定量檢測了2015 年1 月至12 月間在膠州灣采集的環境DNA 樣品, 夜光藻配子細胞在全年均有檢出, 其豐度呈現顯著的季節變化(P＜0.01,Kruskal-Wallis One-Way ANOVA); 對各月份間進行兩兩比較發現, 在冬末春初的2～3 月和夏季的7 月出現兩個顯著的高峰(P＜0.05), 冬季的12 月顯著低于其他月份(P＜0.05)。1～5 月, 配子豐度呈先升高后降低的趨勢, 于 2 月達到全年最高水平, 其豐度范圍為0.11×105～9.70×105cells/L, 年最高值出現在D5 站的表層; 6～9 月, 配子豐度再次先升后降, 并于7 月出現次高峰, 其豐度范圍為0.07×105～1.20×105cells/L, 最高值同樣出現在D5 站的表層; 此后, 配子豐度在11月略有回升后, 至12 月降至全年最低, 此時除D8 站外, 所有站位配子豐度都在100 cells/L 以下, 在D3站的表層出現全年最低值, 為18.12 cells/L (圖6a)。

圖6 膠州灣夜光藻配子細胞與營養細胞豐度的周年變化Fig.6 Annual variation in abundances of N. scintillans gametes and of vegetative cells in Jiaozhou Bay

選取灣內近岸的A5 站、灣中心的C3 站、灣口的D5 站和灣外的D7 站作為典型站位, 研究了夜光藻配子細胞的垂直分布(圖7)。A5 站在全部月份的表底差異均不明顯; 其他站位在2～3 月、7 月和11 月呈現明顯的表底差異。在2～3 月, D5 站配子豐度按表層、10 m 層、10 m 以下水層的順序遞減, C3 站和D7 站的底層豐度高于表層。在7 月, D5 站和D7 站均為表層豐度最高, 表層以下水層差異不大。在11 月, C3站的表層豐度略高于底層, D5 站則在底層出現了非常明顯的配子豐度高值。但從全年來看, 配子豐度與水深的Spearman 相關性不顯著(R=0.079,P＞0.05)。

圖7 配子細胞在典型站位的垂直分布Fig.7 Vertical distribution of gametes in typical stations

水柱平均配子豐度在不同站位的年平均值示于圖8a, 配子細胞在灣內水深小于10 m 的站位(A3、A5、B2、C1、C4 站)豐度較低, 在灣中心、灣口和灣外水深大于10 m 的站位豐度較高, 最高值出現在灣中心的C3 站。全年來看, 水柱平均配子豐度在水深小于10 m 的站位和大于10 m 的站位存在顯著差異(P＜0.01, Mann-WhitneyUtest); 在2～4 月、7～9 月和11 月, 水深大于10 m 站位的水柱平均配子豐度顯著高于水深小于10 m 的站位(P＜0.05), 其余月份則沒有顯著差異(P＞0.05) (圖8b)。

圖8 水柱平均配子豐度在不同站位的分布(*P ＜ 0.05)Fig.8 Distribution of gametes abundance in different stations(*P ＜ 0.05)

夜光藻營養細胞豐度同樣呈現顯著的季節變化(P＜0.01, Kruskal-Wallis One-Way ANOVA), 最高值出現在2 月的C4 站, 為31.37 cells/L; 最低值出現在11月的C4 站和12 月的A3、B2、C1 站, 均未檢出。對營養細胞豐度和水柱平均配子豐度進行分析, 發現營養細胞豐度與配子豐度的月度變化基本一致, 最高峰都出現在2 月, 并在7 月出現次高峰, 最低值都出現在12 月(圖6b), Spearman 相關性分析顯示二者極顯著正相關(R=0.759,P＜0.01)。在2 月最高峰發生前后的1、4 月, 雖然營養細胞豐度處于同一水平(P＞0.05, Mann-WhitneyUtest), 但4 月的配子豐度顯著低于1 月(P＜0.05, Mann-WhitneyUtest), 其月平均值分別為(7.28±8.32)×103和(1.78±1.38)×104cells/L;在7 月次高峰發生前后的6、9 月, 營養細胞豐度與配子豐度均不存在顯著差異(P＞0.05; Mann- WhitneyUtest)。

3 討論

有性繁殖可能在夜光藻的種群增長中發揮重要作用(Fukudaet al, 2006; Miyaguchiet al, 2008;Sriwoonet al, 2008; 宋書群等, 2016), 定量檢測自然水體中的夜光藻配子, 研究其時空分布特征, 有助于闡明夜光藻有性繁殖與種群增長的關系。傳統的浮游植物采集、保存、鏡檢技術只能計數自然水體中夜光藻的營養細胞、二分裂細胞和配子母細胞(周成旭等,1994; Uhliget al, 1995; Sriwoonet al, 2008)。然而, 夜光藻配子細胞粒徑較小(10～15 μm), 難以固定保存,且形態類似裸甲藻, 在光學顯微鏡下不易鑒別(Elbr?chteret al, 1998; Fukudaet al, 2006), 傳統的鏡檢技術無法對其進行鑒定和計數。近年來, 流式細胞術、熒光原位雜交和qRT-PCR 等技術廣泛應用于浮游植物的鑒定與計數。流式細胞術可以根據細胞粒徑和熒光特性對粒徑小于50 μm 的細胞進行類群劃分和計數, 常用于微微型浮游植物(picophytoplankton,＜2 μm)的檢測(晁敏等, 2003), 但很難在環境樣品中鑒定到種。熒光原位雜交技術能夠利用特異性核酸探針對浮游植物進行定性分析, 但定量分析需要在固定、離心、裂解及雜交等步驟后保持細胞不變形、不出現因破碎導致的團聚現象, 否則會對后續的熒光顯微計數造成很大的困難(張寶玉, 2005)。qRT-PCR技術具有高特異性與靈敏度, 廣泛應用于多種海洋藻類的野外監測(Heet al, 2007; 高巖等, 2013; Huet al, 2022; Liet al, 2022), 能夠區分同一屬的不同物種(Blomsteret al, 2000; Yuanet al, 2012), 其檢出限甚至可以在個位數以下, Li 等(2010)定量檢測水體中血卵渦鞭蟲(Hematodinium perezi)的檢出限可低至每反應0.01 個細胞; 另外, 該方法對樣品保存的要求較低,現場即可完成真空抽濾采樣與液氮速凍保存工作,很大程度上避免了細胞數量的損失。

Miyaguchi 等(2008)在相模灣(Sagimi Bay)曾嘗試建立夜光藻配子的qRT-PCR 定量檢測方法, 但其標準工作曲線沒有體現出良好的線性響應(R2=0.722 5)。在本研究中, qRT-PCR 熔解曲線顯示單峰, PCR 擴增產物的測序結果與目標序列完全匹配, 說明參照rRNA 基因的18S-ITS1 區域設計的引物能夠從環境樣品中精準地識別夜光藻的序列。兩種標準品的qRT-PCR 擴增效率(95.40%, 95.23%)及R2值(0.993 7,0.999 6)均 在 理 想 范 圍 內(90%～110%,R2＞0.980 0)(Tayloret al, 2010), 能夠實現對水體中配子細胞的準確計算。以500 mL 的濾水體積、30 μL 的DNA 提取洗脫體積和1 μL 的qRT-PCR 分析體積計算, 本研究中檢測到的最低配子豐度(18.12 cells/L)可換算為每反應0.30 個細胞, 高于細胞數標準曲線的檢出限(每反應0.17 個細胞), 完全可以滿足野外監測工作的需求。

應用qRT-PCR 技術檢測細胞豐度時, 標準工作曲線的構建至關重要。在過去的研究中, 檢測標準品通常有兩種, 即重組質粒標準品與基因組DNA 標準品, 二者在不同的實驗目的下各有其優勢。重組質粒的制備便捷, 經測序驗證后的標準品經長期保存, 反復凍融后仍可保證其穩定性(Yuanet al, 2012); 以重組質粒為標準品在彭宇科等(2011)與本研究中均表現出了更好的線性響應, 雖然無法直接獲得細胞豐度,但可用于比較夜光藻配子細胞這類不易保存、鑒定的細胞在不同時間、空間的拷貝數豐度。以基因組DNA為標準品能通過計算獲得更為直觀的細胞豐度數據,其實是以標準品對應的細胞豐度為參照的相對值,因此其準確性與細胞所含靶基因的拷貝數密切相關,不同藻株、不同時期細胞所含拷貝數的差異會影響該方法的準確性(Galluzziet al, 2004; 高巖等, 2013)。本研究專一地針對夜光藻生活史中的配子細胞階段,不需考慮不同細胞階段間拷貝數的差異, 但夜光藻不同地理類群間的rRNA 基因拷貝數是否存在差異尚不清楚, 建議在實際應用時以當地株的配子細胞建立標準工作曲線。

本研究應用qRT-PCR 技術定量檢測膠州灣的夜光藻配子細胞, 研究了其時空分布特征, 分析了其與營養細胞豐度的關系, 發現配子細胞具有促進種群增長的潛力。夜光藻的營養細胞與配子細胞在全年尺度上是緊密相關的, 兩種細胞不僅呈現一致的月際變化趨勢, 在相關性分析中也表現出顯著的正相關關系(P＜0.01); 這與Miyaguchi 等(2008)的研究結果相吻合,在相模灣配子豐度高值多出現在營養細胞豐度高值之前或同時出現。在夜光藻種群大規模增長之前, 可能存在有性繁殖細胞發生的活躍期。營養細胞豐度在2～3 月的峰值發生前后沒有顯著差異(P＞0.05), 但1 月的配子豐度卻顯著高于4月(P＜0.05), 同期采集的配子母細胞在種群中的比例也高于4 月(田達瑋等, 2017)。Sriwoon 等(2008)發現泰國灣(Gulf of Thailand)的綠色夜光藻無論是在自然水體還是培養于實驗室內, 配子母細胞均在其快速增長期頻繁出現。Miyaguchi 等(2008)與本研究都發現配子細胞在水體中全年存在,即使網采樣品中沒有檢出夜光藻細胞, 該站位仍有配子細胞被檢出, 說明在營養細胞豐度極低的水體中,配子的存在可能是種群延續的關鍵之一。

膠州灣夜光藻的營養細胞與配子細胞呈現不同的時空分布模式。營養細胞的水平分布具有一定的季節規律: 1～2 月, 細胞豐度在灣內東側靠近河流入?？诘恼疚蛔罡? 3 月, 僅C1 站和D1 站豐度略低, 其他站位差異不大; 4～9 月, 細胞豐度的高值多出現在灣口和灣外; 10～12 月, 高值分別出現在灣內、灣口和灣外(田達瑋等, 2017)。配子細胞的水平分布沒有明顯的季節變化, 全年均表現出灣內近岸站位低于灣中心、灣口和灣外站位的分布規律。以水深是否超過10 m 分組, 配子豐度在較深的站位總體上高于分布在灣內近岸的較淺站位, 這可能與10 m 層的營養細胞活力較高有關, Tada 等(2020)發現雖然表層水體中營養細胞豐度較高, 但活力極低, 較深的站位可能為夜光藻提供了適宜有性繁殖的水層。淺水站位受風、海流和潮汐等物理因素的驅使, 易導致營養細胞的聚集(Zhanget al, 2017, 2020), 但表層大量衰弱的營養細胞沒有能力進行旺盛的繁殖活動, 可能造成灣內近岸站位的配子豐度呈現低值。

夜光藻配子細胞在水體中的形成與擴散可能受多種因素影響。在膠州灣, 配子豐度垂直分布總體上比較均勻。水深較淺時, 可能與水體垂直混合均勻有關(康美華, 2014)。同時, 夜光藻餌料的垂直分布也可能影響配子的形成。夜光藻的有性繁殖需要吞噬營養的支持, 在葉綠素a濃度低的月份, 觀察不到配子母細胞的存在(田達瑋等, 2017); 在不投喂食物的情況下,綠色夜光藻不能形成配子母細胞(Sriwoonet al, 2008)。其次, 夜光藻在自然水體中存在晝夜遷移現象(張天文等, 2009), 其無性繁殖存在明顯晝夜節律(陳漢輝等,1991; Uhliget al, 1995), 有性繁殖也可能存在節律性,調查時采集到的樣品只能代表該站位的瞬時狀態, 可能影響對配子細胞垂直分布的整體描述。另外, 膠州灣局部海域在盛夏期間會形成溫躍層(楊玉玲等,1999), 水體的層化也可能影響配子細胞的垂直分布。

4 結論

(1) 以夜光藻rRNA 基因的18S-ITS1 為靶區域,建立了一種能快速、靈敏定量檢測水體中夜光藻配子的qRT-PCR 方法, 檢出限為每反應0.17 個細胞或102個拷貝, 在分析室內培養的其他海洋微藻和環境水樣時均表現出良好的特異性。

(2) 2015 年膠州灣水體中的夜光藻配子豐度呈雙峰分布, 最高峰出現在2～3 月, 次高峰出現在7 月;配子細胞的水平分布可能受存在于10 m 水層的高活力細胞群體的影響, 呈現灣內近岸淺水站位低于灣中心、灣口和灣外深水站位的分布規律; 配子細胞總體在垂向分布均勻, 深水站位的個別月份存在垂直差異。

(3) 在營養細胞最高值出現的月份及前一個月,水體中存在的大量配子細胞可能促進種群增長; 在營養細胞豐度極低時, 水體中的配子細胞對種群存續有潛在的積極意義。

致謝數據在膠州灣海洋生態系統國家野外科學觀測研究站幫助下產生, 謹致謝忱。