馬兜鈴酸減毒與分離方法研究進展*

程 玉，余寒優，索 芳，任 青，張迎慶

（湖北工業大學生物工程與食品學院制藥工程系，湖北 武漢 430068）

馬兜鈴科植物在《神農本草經》《雷公炮炙論》《肘后備急方》《婦人大全良方》等文獻中均有記載。其品種有600 多種，分布廣泛，在世界各地有數百個品種被用于治療疾病，如馬兜鈴屬在印度用于解蛇毒、緩解關節痛和發熱，在巴西用于止瀉、鎮痛、消炎、抗癌等。我國含馬兜鈴酸的藥材主要包括馬兜鈴科馬兜鈴屬AristolochiaL. 和細辛屬AsarumL.，如馬兜鈴、天仙藤、朱砂蓮、細辛、關木通、青木香、廣防己、尋骨風等［1］。馬兜鈴科植物中的馬兜鈴酸具有強烈的致癌性和腎毒性［2-3］，是3，4-次甲二氧基-10-硝基-1-菲酸衍生物，有多種基本組成結構。目前，有明確毒性作用的成分有馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ［4］，其余部分的腎毒性及致癌性差異尚未明確。馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ在體內硝基還原酶的作用下，一部分被還原為馬兜鈴內酰胺，進入腎小管上皮細胞，經長時間積累而導致毒性；另一部分在還原過程中進一步與DNA 作用，形成加合物，直接損傷DNA，最終導致基因突變，產生毒性。流行病學證據表明，馬兜鈴酸能與DNA 形成親電加合物，并出現具有突變標識特征的堿基對“A∶T →T∶A 顛換突變”，致人體患癌［5-6］。據國際致癌物評價標準，確認馬兜鈴酸為一級致癌物［7］。故各國均限制或禁止銷售和使用含馬兜鈴酸的中藥材和中成藥，我國也取消了關木通、青木香、廣防己的藥材標準，并對含馬兜鈴、尋骨風、天仙藤、朱砂蓮的中藥制劑按處方藥的標準進行嚴格管理，并在藥品標簽和藥品說明書中增加可引起腎臟損害的安全警示信息。2020 年版《中國藥典（一部）》剔除了天仙藤和馬兜鈴，僅收錄細辛，規定藥用部位為根和根莖，并對限度進行了嚴格規定。同時，提高了相關中成藥制劑的藥品標準，擬增加馬兜鈴酸限量檢查，近年來關于馬兜鈴酸減毒的研究日益增多［8-9］。為此，在馬兜鈴酸傳統減毒方法的基礎上，綜述了現代分離純化技術在馬兜鈴酸的減毒、固相萃取富集分析，以及在不同馬兜鈴酸組分標準品制備中的應用與研究進展，為含馬兜鈴酸中藥材的合理使用和相關中成藥的檢測提供參考?，F報道如下。

1 傳統減毒方法

1.1 炮制減毒

炒焦：嚴建業等［10］研究了細辛的不同炮制方法，馬兜鈴酸減毒效果按炒焦> 堿醋制> 鹽制> 堿制> 醋制>米泔水制>甘草制>酒制>蜜制>姜制順序依次降低。其中，炒焦工藝對細辛中馬兜鈴酸Ⅰ的去除率最高，超過60%（質量分數）。

醋炙：李天鳳等［11］對關木通進行姜炙、醋炙、蜜炙、甘草炙、堿制、炒炙、酒炙，以及堿蜜合制、堿酒合制、堿姜合制，并采用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法測定各炮制品馬兜鈴酸的含量，計算其脫除率。結果關木通醋炙品中馬兜鈴酸含量較低，且其醋炙品水浸出物與醇浸出物的含量均較高。與其他方法相比，醋炙法更穩定。

蜜炙：章瑩等［12］分析不同產地馬兜鈴蜜炙后的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，發現蜜炙后馬兜鈴酸Ⅰ含量降低了36%，且最適蜜炙條件為加蜜量30%（質量分數），蜜 - 水比例為1∶3（V/V），溫度為200 ℃，加熱25 min。

潤洗、陰干：姜思奇等［13］研究了北細辛飲片的炮制工藝與藥材質量間的相關性。結果顯示，北細辛藥材潤洗5 min、24.6 ℃陰干24 h，或潤洗5 min、25.0～35.0 ℃烘干8 h，均可符合北細辛飲片要求。綜合考慮后，將北細辛藥材潤洗48 h，24.6 ℃陰干48 h，馬兜鈴酸Ⅰ的含量由9.87 μg/g 降至7.99 μg/g。故可將其作為北細辛飲片的減毒工藝。

發酵：發酵法通過微生物降解中藥中有毒物質，與普通炮制方法相比優勢顯著，其工藝條件溫和，無污染。曹藝等［14］采用液體發酵技術，以關木通、青木香、馬兜鈴、尋骨風藥材粉末為原料，在黑曲霉、米曲霉等10個菌種的發酵降解下進行生物轉化脫毒。采用超高效液相色譜（UPLC）法測定發酵前后藥材中馬兜鈴酸Ⅰ的含量，結果表明，枯草芽孢桿菌可降低藥材中馬兜鈴酸Ⅰ的含量。LIU 等［15］采用高效液相色譜 - 電噴霧飛行時間質譜法測定馬兜鈴植物根部與6 種不同藥用真菌經固態發酵所得發酵產物中馬兜鈴酸的含量，擬訂色譜條件［色譜柱為C18柱，檢測器為二極管陣列檢測器，溫度為30 ℃，流動相為乙腈（A）-0.2%乙酸（B）］進樣測定。結果發現，0～20 min 內出現了新的色譜峰，采用柱后分流法進行電噴霧離子化質譜（ESI- MS）負離子模型檢測，推斷出7個馬兜鈴酸成分。在發酵過程中，上述7 種化合物含量均減少，說明發酵可有效減毒。此外，優化后的HPLC - MS 法有助于馬兜鈴酸的含量測定。向薇［16］從馬兜鈴根際土壤中獲得33 株純培養菌株，經驗證，其中11株均對馬兜鈴酸Ⅰ有降解作用，在非優化條件下48 h 內可最多降解85.36%（質量分數）的馬兜鈴酸Ⅰ。將獲得的降解菌株用于馬兜鈴酸Ⅰ含量較高的青木香進行發酵炮制，再結合篩選得到的分子標志物進行腎毒性評價，效果較好。

1.2 配伍減毒

單味藥：配伍的單味中藥主要有補益類中藥黃芪、冬蟲夏草、當歸、甘草等，活血類中藥丹皮、丹參等，清熱類中藥生地黃、竹葉、黃連等，瀉下類中藥大黃等［17］。馬艷苗等［18］通過RP-HPLC 法考察了關木通配伍苦寒藥黃連后馬兜鈴酸Ⅰ的含量變化趨勢。結果顯示，不同比例配伍組中馬兜鈴酸Ⅰ的含量不同，特別是關木通與黃連配伍比例為1∶1.5（m/m）時，馬兜鈴酸Ⅰ含量下降了72%（質量分數）。提示“寒寒相配”的中藥配伍形式有助于降低關木通中馬兜鈴酸Ⅰ的含量，中藥配伍減毒理論有一定科學依據。邵珠瑩等［19］采用超高效液相色譜- 三重四極桿質譜串聯（UPLC - TQD - MS）法探討了關木通配伍干姜的減毒存效機制，結果顯示，關木通-干姜（1∶2，m/m）配伍組馬兜鈴酸Ⅰ對大鼠急性腎功能的損傷程度顯著低于生品組，且不影響對大鼠的利尿作用。

復方：汪瀟晗等［20］報道了復方（如龍膽瀉肝湯、復方導赤散）與拆方配伍對關木通減毒作用的影響，發現復方配伍組中馬兜鈴酸溶出量較關木通單煎組顯著下降。曹小帥等［21］采用中成藥制劑配伍來減毒，如腦靈片由黃精、紅參、鹿茸等11味中藥材組方，有補氣血、養心腎功效，與關木通共煎后，測得的馬兜鈴酸Ⅰ含量明顯降低。

在傳統中醫基礎理論指導下，中藥配伍可實現減毒增效。按準確配伍用量，采用現代炮制技術能減少其大部分毒性成分，但尚需制訂詳細的量化指標及使用規范，以指導臨床使用。

2 分離純化方法

2.1 超臨界流體萃取法

超臨界流體萃取法是利用超臨界流體提取、分離有效成分的新技術。超臨界流體的溶解性、滲透性及擴散性能均高，黏度低，通過改變壓力或溫度來調節其溶解能力，實現對不同成分高選擇性地提取分離，多用于天然活性物質的提取分離［22-24］。LIANG 等［25］評價了超臨界流體萃取法去除馬兜鈴和關木通中馬兜鈴酸的可行性，結果表明，萃取方式和夾帶劑的摩爾分數是影響馬兜鈴酸萃取的主要因素。去除馬兜鈴酸的最適動態條件為容器壓力194 bar，溫度50 ℃，夾帶劑濃度0.2 摩爾分數，萃取4 h。結果顯示，馬兜鈴中馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ的去除率分別為65.2%和59.1%（質量分數），關木通中的去除率分別為81.3%和81.2%（質量分數）。

2.2 分子印跡法

2.2.1 減毒

分子印跡是一種為獲得在空間結構和結合位點上與特定目標分子相匹配的聚合物的技術，制備的分子印跡聚合物（MIP）對目標分子具有特異性和選擇性，廣泛用于中藥研究［26-27］。肖榕［28］采用可逆加成斷裂鏈轉移聚合（RAFT）法制備了馬兜鈴酸分子印跡微球，并對其吸附性能進行研究。以馬兜鈴酸Ⅰ為模板分子，丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）為交聯劑，二硫代苯甲酸（4-氰基戊酸）酯為鏈轉移劑，偶氮二異丁腈（AIBN）為引發劑，二甲基甲酰胺-水溶液（8∶2，m/m）為致孔劑，采用RAFT 技術制備MIP，其收率為63.42%。所得MIP 對模板馬兜鈴酸Ⅰ具有良好的特異性和選擇性吸附能力，可至少重復使用6 次。取25.0 mg MIP 可吸附5.0 mL 關木通乙醇提取物（馬兜鈴酸Ⅰ質量濃度為0.001 8 mg/mL），結果馬兜鈴酸Ⅰ含量降至液相的檢測限（6.47 ng/mL）以下，平均回收率為41.70%。結果表明MIP 可用于去除天然產物中馬兜鈴酸Ⅰ。

2.2.2 固相萃取富集

固相萃取是常用的樣品分析檢測前處理技術，通過固體吸附劑吸附液體樣品中的目標物質，與其他干擾物分離，利用洗脫液或加熱解吸附洗脫，達到目標化合物分離和富集的目的［29］。目前，溶劑萃取-柱色譜分離法為常用的馬兜鈴酸富集檢測方法，需多次抽取、萃取、脫色等，以及柱色譜分離，操作煩瑣，耗時，成本高，富集效率不高，提取量受限。一般固相萃取材料采用C18柱和C8柱，對強保留雜質無法有效去除。MIPs合成的固相萃取材料因識別性能好、富集效率高而受到青睞。分子印跡技術用于馬兜鈴酸的分析檢測預處理時，可從中藥材浸取液中經固相萃取富集分離馬兜鈴酸，檢測靈敏度高。

傅強等［30］報道了從中成藥龍膽瀉肝丸中富集與檢測微量馬兜鈴酸Ⅰ的方法，首先進行硅膠活化，對硅膠表面進行氨基化改性，再在硅膠表面合成MIP；將所得MIP 裝柱，以甲醇活化，制備得到分子印跡-固相萃取柱，可用于檢測富集中成藥龍膽瀉肝丸中的馬兜鈴酸Ⅰ。該方法操作簡單，且采用偽模板分子氧氟沙星代替馬兜鈴酸Ⅰ，富集過程安全、環保，結合容量高，傳質速率快，富集效率高。GE 等［31］也報道，以偽模板分子氧氟沙星代替馬兜鈴酸Ⅰ制備的MIP作為固相萃取吸附劑，從中藥材中分離富集馬兜鈴酸。結果顯示，馬兜鈴酸Ⅰ富集達16 倍，其質量濃度在0.1～200.0 μg/mL 范圍內線性關系良好（R2=0.998 7），回收率為64.94%～77.73%，精密度試驗的RSD≤0.8%。

GE 等［32］合成了一種混合磁性介孔碳分子印跡聚合物（MMC@MIPs），用于從大鼠尿液樣本中選擇性識別馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ。以氯化膽堿/乙醇基深共晶溶劑和吲哚美辛分別作為洗脫劑和假模板分子，研究了制備材料的形貌、結構和表面基團，并篩選MMC@MIPs - MSPE 工藝的最佳條件。結果表明，該方法回收率較好（86.7%～94.3%），標準偏差較?。?4.85%），在0.5～30 μg/mL質量濃度范圍內線性關系良好（R2為0.991 0～0.996 0）。

LI 等［33］報 道 了 MIP 功 能 化 的 磁 性 碳 納 米 管（MCNTs）對馬兜鈴酸Ⅰ的去除效果。通過一種簡便、環保的溶膠-凝膠工藝獲得MCNTs@AAI-MIPs，先用溶劑熱法合成MCNTs，在乙醇和水的作用下，模板分子與功能單體苯三甲氧基硅烷自組裝，以正硅酸四乙酯為交聯劑，在MCNTs 上涂覆馬兜鈴酸Ⅰ- MIPs 膜，得到MCNTs@馬兜鈴酸Ⅰ-MIPs。結果表明，印跡納米復合材料分離速度快（10 s），吸附容量高（18.54 μg/mg），動態平衡時間短（15 min），選擇性好，模板分子印跡因子為3.17，可從復雜的中藥樣品中有效、特異地提取馬兜鈴酸Ⅰ。

陸雅婷等［34］采用表面分子印跡技術制備了馬兜鈴酸Ⅰ磁性MIPs，載體為經過硅殼改性后的Fe3O4，功能單體為甲基丙烯酸，交聯劑為EGDMA，引發劑為AIBN，溶劑體系為乙腈-甲醇（3∶1，V/V），且模板分子、功能單體、交聯劑質量比為1∶4∶20，形成表面印跡層，得到對馬兜鈴酸Ⅰ有特異性吸附作用的MIPs，印跡效率可達3.11，可用于實際樣品中馬兜鈴酸Ⅰ的富集和分析。

2.3 吸附法

2.3.1 減毒

孫博航等［35］報道了采用離子交換法從中藥材北細辛中獲得無毒提取物的制備工藝。北細辛全草經熱水煎煮提取，取濾液，冷卻后調節pH 值。采用陽離子、陰離子交換法，可去除北細辛藥材中具有揮發性的黃樟醚，以及非揮發性的馬兜鈴酸、烏頭堿、去甲烏頭堿等有毒成分，能較好地保留有效成分，兼顧性強，工藝簡單，能源消耗低，節約資源，生產過程清潔無污染。

2.3.2 固相萃取富集

張曉哲等［36］大孔樹脂法富集馬兜鈴酸預處理，采用自制價廉的大孔吸附樹脂萃取柱，大孔吸附樹脂填料為HPD-100/Diaion/AB-8，填料裝填體積保持為上樣溶液體積的2～5 倍，以不高于40%甲醇或乙醇溶液除去雜質，以70%～100%甲醇或乙醇溶液洗脫富集馬兜鈴酸類化合物，回收率高，穩定性好，價格低廉，更適合微量馬兜鈴酸的富集和高靈敏測定。

FANG 等［37］報道了一種雙離子液體固定化硅膠多相萃取馬兜鈴酸的方法，可從實際樣品中分離馬兜鈴酸。結果顯示，在60 ℃的流動相甲醇 - 水（60∶40，V/V）中，與其他吸附劑相比，IM -BIM@Sil 提取的馬兜鈴酸量最多（16.69 mg/ g）。將該吸附劑用于馬兜鈴酸的多相萃取，經過提取8 次，多次洗滌和洗脫，從9 個真實樣品中分離到（2.4～70.9）× 10-3mg/ g 馬兜鈴酸，回收率為70.0%～110.6%，RSD為3.5%～9.1%，表明方法準確性高。

CHEN 等［38］將雙離子液體固定于一種金屬-有機骨架ZIF-67制備成吸附劑，用于黃藤中馬兜鈴酸Ⅰ固相萃取。吸附模型分析結果顯示，在25 ℃下120 min內，固定化吸附劑的吸附量最高（50.9 mg/g）。固相萃取過程中每1 g 藥材可除去0.02 mg 馬兜鈴酸Ⅰ，回收率為96.2%～100.0%，RSD為3.5%～4.0%。

SHU 等［39］將螺旋碳纖維與殼聚糖雜化材料作為固相萃取吸附劑，用于馬兜鈴酸分析檢測的富集預處理。利用螺旋碳纖維的超強容量，并在表面修飾殼聚糖，殼聚糖帶有大量氨基和乙酰氨基，在稀酸溶液中易質子化并以陽離子形式存在，能與有機酸通過靜電相互作用形成復合物，并通過控制pH 實現選擇性吸附和脫附。殼聚糖改性螺旋碳纖維對馬兜鈴酸Ⅰ結合能力優良（77.72 mg/ g），選擇性高。采用固相萃取結合HPLC法對藥用植物中馬兜鈴酸Ⅰ進行了富集和檢測。馬兜鈴酸Ⅰ的質量濃度在0.5～150 mg/L 范圍內線性關系良好，回收率為73.61%～77.73%，RSD<5%。

SHU 等［40］報道了腺嘌呤修飾的磁性多壁碳納米管用于基于多種相互作用的馬兜鈴酸的選擇性提取。該吸附劑對馬兜鈴酸的吸附量為24.5 μg/mg，建立了富集和檢測中藥中馬兜鈴酸的磁性固相萃取-高效液相色譜法。馬兜鈴酸Ⅰ的回收率為92.7%～97.5%，馬兜鈴酸Ⅱ的回收率為92.6%～99.4%，RSD<4%。

2.4 液液色譜法

為了分離毫克級的不同類型馬兜鈴酸，采用無固相支持的液液色譜技術，如逆流色譜（CCC）法和離心分配色譜（CPC）法均可適用于分離極性次級代謝產物，無論是在洗脫或pH 區帶精制和離子交換置換模式下均可進行。強離子交換模式離心分配色譜（SIX -CPC）法適用于分離離子化或可離子化的代謝產物，如羥基肉桂酸、迷迭香酸、硫代葡萄糖苷、花青素、皂苷或多肽。SIX-CPC法中交換劑為離子型，在任何pH下均保持正電荷（陽離子交換劑）或負電荷（陰離子交換劑），陰離子交換劑主要是苯扎氯銨、三辛基甲基氯化銨（Aliquat 336?）等季銨鹽，離子型分析物形成穩定的離子對直接捕獲到固定相中。無置換劑的流動相不能洗脫所提取的分析物，加入置換劑時分析物出現在流動相中。所有分析物沿柱以相同的速率移動，而移動速率取決于置換劑的濃度。SIX-CPC 法會通過不同分析物與交換劑間形成離子對的差異實現高分辨純化。ABDELGADIR等［41］采用基于強離子交換置換的SIX -CPC 法提取純化了的小苞馬兜鈴（Aristolochia bracteolataLam.）的馬兜鈴酸，一步制備便可分離得到馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲa。方法為采用雙相溶劑系統甲基叔丁基醚-丙酮 -甲醇 - 水（3∶1∶1∶3，V/V/V/V），三辛基甲基氯化銨（Aliquat 336?）為有機固定相的陰離子交換劑，碘化鈉為水流動相的置換劑。從5 g 小苞馬兜鈴粗提物中分別得到45.5，77.2，35.1 mg馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲa，純度均大于95%（質量分數）。

段文娟等［42］報道了一種基于pH 區帶逆流色譜技術的快速分離純化馬兜鈴酸類化合物的方法，能對關木通藥材中的馬兜鈴酸類化合物實現有效分離純化。該方法在普通制備型高速逆流色譜分離純化有機酸類成分的應用基礎上發展而來，并根據化合物解離常數（pKa）大小依次洗脫，尤其適合有機酸類物質的分離。pH區帶逆流色譜法進樣量分離效率均高，分離效果好，雜質易收集，可實現pH 監控，待分離組分被高度濃縮。由于馬兜鈴酸類化合物苯環上連接的基團不同，化合物的pKa 也存在一定差異，故可采用pH 區帶逆流色譜法進行富集與分離。具體方法：將關木通粉碎后使用乙醇加熱回流提取，減壓濃縮得浸膏，加水混旋，使用石油醚、乙酸乙酯萃取，減壓蒸干得馬兜鈴酸總提取物；采用pH 區帶逆流色譜進行分離與富集，以石油醚-乙酸乙酯 - 正丁醇 - 水體系（5∶5∶1∶6，V/V/V/V）為溶劑分層后在上相固定相和下相流動相中分別加入一定量的三氟乙酸和三乙胺，泵入高速逆流色譜儀后進行分離純化，可在10 h內一次性制備4個純度大于95%的馬兜鈴酸組分（馬兜鈴酸Ⅰ、馬兜鈴酸Ⅱ、馬兜鈴酸Ⅲa、馬兜鈴酸Ⅳa），制備成本低于現有技術，操作簡便，效率高，且環保，明顯優于現有硅膠柱色譜法或HPLC法。

3 結語

具有致癌性和腎毒性的馬兜鈴酸是中藥材的常見成分，在傳統減毒增效方法的基礎上，現代分離純化技術可達到減毒增效、富集分離純化的效果。