訶黎勒酸和訶子酸的提取、分離工藝優化Δ

陳九妹，朱麒臻，鞠成國，張強，王?。ㄟ|寧中醫藥大學藥學院，遼寧 大連 116600）

訶子為使君子科植物訶子Terminalia chebulaRetz.或絨毛訶子T.chebulaRetz.var.tomentellaKurt.的干燥成熟果實，具有澀腸止瀉、斂肺利咽的功效，主要用于治療久瀉久利、咽痛音啞，現收載于2020年版《中國藥典》（一部）[1]。訶子具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[2－3]，在蒙、藏醫藥方劑中使用廣泛。鞣質類成分是訶子的主要化學成分，其含量達23.6%～37.4%，主要包括沒食子酸、訶子次酸、鞣花酸、訶黎勒酸、訶子酸等成分[4]，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等作用[5]。本課題組前期通過對10批不同產地訶子藥材含量分析發現，訶黎勒酸平均含量約10%，訶子酸平均含量約7%，含量較高[6]。有研究從訶子植物親緣學、傳統藥效藥性、臨床應用、化學成分等方面進行分析得出，訶黎勒酸和訶子酸為訶子的質量標志物[7]；也有研究認為，訶黎勒酸、訶子酸含量與訶子藥材的品種、性狀、質量均具有相關性[8]，因此這2個成分可作為訶子藥材質量控制及質量溯源的重要指標。目前，有研究采用大孔吸附樹脂富集后結合制備型高效液相色譜、高速逆流色譜等方法分離制備訶黎勒酸、訶子酸，但分離過程復雜、產率低、成本高[9－10]。為此，本研究以訶黎勒酸和訶子酸含量為指標，優化2種成分的提取、分離工藝，得到其純品，旨在為訶子藥材藥效物質研究及質量控制提供基礎。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器有Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）、FA1004B型分析天平（上海精密科學儀器有限公司）、DFT-100型粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）、410HTD型數碼超聲波清洗機（深圳市潔拓超聲波清洗設備有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

訶黎勒酸對照品（批號PRF8112302）、訶子酸對照品（批號PRF8071201）均購自成都普瑞法科技開發有限公司，純度均大于98%；甲醇為色譜純，乙醇、磷酸均為分析純，水為超純水。訶子藥材于2019年購自河北安國藥材市場（產地云南），經遼寧中醫藥大學藥學院翟延君教授鑒定為使君子科植物訶子T.chebulaRetz.的干燥成熟果實。

2 方法與結果

2.1 訶黎勒酸和訶子酸含量測定方法的建立

2.1.1 色譜條件 以Diamonsil Plus C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以0.1%磷酸溶液（A）-甲醇（B）為流動相進行梯度洗脫（0～8 min，5%B→10%B；8～15 min，10%B→25%B；15～25 min，25%B；25～30 min，25%B→30%B；30～50 min，30%B→45%B；50～55 min，45%B）；進樣量為 10 μL；流速為 1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為270 nm。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 取訶黎勒酸、訶子酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成訶黎勒酸、訶子酸質量濃度分別為418、413 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 取訶子粉末（過四號篩）約0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理（功率240 W，頻率40 kHz，下同）20 min，放冷，再次稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.1.4 專屬性試驗 取上述供試品溶液、混合對照品溶液和空白溶液（70%甲醇），按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜圖（圖1，空白圖略）。結果顯示，各待測成分的色譜峰與相鄰峰分離度均大于1.5，空白溶液無干擾。

2.1.5 線性關系考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液適量，用甲醇逐級稀釋，制得訶黎勒酸質量濃度分別為209.0、104.5、52.25、26.13、13.06、6.531、3.266 μg/mL，訶子酸質量濃度分別為206.5、103.3、51.63、25.81、12.91、6.453、3.227 μg/mL的系列線性工作溶液，取上述系列線性工作溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。以待測成分的質量濃度為橫坐標（X）、峰面積為縱坐標（Y）進行回歸分析。結果顯示，訶黎勒酸的回歸方程為Y＝11.815X－9.087 9（r＝0.999 9），訶子酸的回歸方程為Y＝11.846X－4.200 0（r＝0.999 9），表明訶黎勒酸質量濃度在3.266～209.0 μg/mL、訶子酸在3.227～206.5 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.1.6 精密度試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果顯示，訶黎勒酸、訶子酸峰面積的RSD分別為0.72%、0.89%（n＝6），表明方法精密度良好。

2.1.7 穩定性試驗 取“2.1.3”項下供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積。結果顯示，訶黎勒酸、訶子酸峰面積的RSD分別為0.98%、1.10%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.1.8 重復性試驗 取訶子粉末，共6份，按“2.1.3”項下方法平行制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并按外標一點法計算樣品含量。結果顯示，訶黎勒酸、訶子酸含量的RSD分別為1.30%、1.20%（n＝6），表明方法重復性良好。

2.1.9 加樣回收率試驗 分別稱取已知訶黎勒酸和訶子酸含量的訶子粉末0.05 g，共6份，精密稱定，分別加入相當于樣品中各成分含量100%的混合對照品溶液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并計算加樣回收率。結果顯示，訶黎勒酸、訶子酸的加樣回收率分別為99.36%（RSD＝0.55%，n＝6）、99.78%（RSD＝0.83%，n＝6），表明方法準確度良好。

2.1.10 樣品中2種成分的含量測定 取訶子樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項下色譜條件進樣分析，記錄峰面積并按外標一點法計算樣品含量。平行測定3次，取平均值。

2.2 訶黎勒酸和訶子酸的提取工藝優化

2.2.1 單因素實驗 （1）根據本課題組前期研究數據，分別對超聲提取、回流提取及常溫浸漬等3種提取方式進行考察。取訶子粉末5 g，共3份，精密稱定，1份置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，密塞，超聲處理40 min；1份置于圓底燒瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，加熱回流2 h；1份置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，搖勻，密塞，靜置24 h。取上述各提取液，濾過，于水浴蒸至近干，真空干燥，分別取相當于0.1 g訶子粉末的干膏，按“2.1.10”項下方法測定訶黎勒酸、訶子酸含量。結果顯示，采用超聲提取時訶黎勒酸、訶子酸含量最高（圖2A），故選擇超聲提取。（2）乙醇體積分數考察。取訶子粉末5 g，共11份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別精密加入不同體積分數的乙醇（0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%）50 mL，密塞，超聲處理40 min，放冷，濾過，于水浴蒸至近干，真空干燥，各取相當于0.1 g訶子粉末的干膏，按“2.1.10”項下方法測定訶黎勒酸、訶子酸含量。結果顯示，當乙醇體積分數為70%時，訶黎勒酸、訶子酸含量最高（圖2B），故選擇乙醇體積分數為70%。（3）液料比考察。取訶子粉末5 g，共6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別以不同液料比（5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，mL/g）精密加入70%乙醇，密塞，超聲處理40 min，放冷，濾過，于水浴蒸至近干，真空干燥，各取相當于0.1 g訶子粉末的干膏，按“2.1.10”項下方法測定訶黎勒酸、訶子酸含量。結果顯示，當液料比為25∶1、30∶1（mL/g）時，訶黎勒酸、訶子酸的含量較高，且趨于穩定（圖2C），考慮到節省試劑，故選擇液料比5∶1、15∶1、25∶1（mL/g）進行后續研究。（4）提取時間考察。取訶子粉末5 g，共6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇125 mL，密塞，分別以不同超聲時間（10、20、30、40、50、60 min）處理，放冷，濾過，于水浴蒸至近干，真空干燥，各取相當于0.1 g訶子粉末的干膏，按“2.1.10”項下方法測定訶黎勒酸、訶子酸含量。結果顯示，當提取時間為10、20 min時，訶黎勒酸、訶子酸的含量均較高（圖2D），考察到提取完全，故選擇提取時間10、20、30 min進行后續研究。（5）物料粒徑考察。取訶子粉末5 g，共6份，分別按不粉碎和粉碎過10目篩、過24目篩、過65目篩、過120目篩、過200目篩處理后，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇125 mL，密塞，超聲處理20 min，放冷，濾過，于水浴蒸至近干，真空干燥，各取相當于0.1 g訶子粉末的干膏，按“2.1.10”項下方法測定訶黎勒酸、訶子酸含量。結果顯示，當物料粒徑為120目時，訶黎勒酸、訶子酸的含量均較高，且趨于穩定，與200目時無差異（圖2E），加之訶子肉的纖維性較強，不易于粉碎為較細的粉末，故選擇物料粒徑24、65、120目進行后續研究。

2.2.2 正交實驗設計 根據單因素實驗結果及參考相關文獻[11－12]，選擇以物料粒徑（A）、液料比（B）、提取時間（C）、提取次數（D）為考察因素，采用L9（34）表進行正交實驗。由于訶黎勒酸、訶子酸均為指標成分，故將兩者的權重系數均設置為0.5。采用加權平均法進行綜合評價，綜合評分＝訶黎勒酸含量/訶黎勒酸含量最大值×0.5×100+訶子酸含量/訶子酸含量最大值×0.5×100。綜合評分越高，表示該工藝參數下所得目標產物越多[13]。正交實驗設計的因素與水平見表1，正交實驗設計方案與結果見表2，方差分析結果見表3。

表1 正交實驗的因素與水平

表2 正交實驗設計方案與結果

表3 方差分析結果

由表3可知，提取結果的影響順序為A＞B＞D＞C，因素A對訶黎勒酸及訶子酸含量有顯著影響（P＜0.05），其他3個因素無顯著影響（P＞0.05）。結合表2結果，得到最佳提取工藝為A3B3C2D2，即物料粒徑120目，液料比25∶1（mL/g），提取時間20 min，提取次數2次。

2.2.3 訶黎勒酸和訶子酸的提取工藝驗證 取訶子粉末50 g，共3份，按“2.2.2”項下最佳提取工藝參數進行提取，放冷，濾過，于水浴蒸至近干，真空干燥，各取相當于0.1 g訶子粉末的干膏，按“2.1.10”項下方法測定訶黎勒酸、訶子酸含量，平行測定3次。結果顯示，平均綜合評分為99.33分（RSD＝0.68%），表明所得最佳提取工藝簡單可行。結果見表4。

表4 訶黎勒酸和訶子酸提取工藝的實驗驗證結果（n＝3）

2.3 訶黎勒酸和訶子酸的分離工藝優化

2.3.1 上樣液濃度的考察 按“2.2.3”項下最佳提取工藝提取，將提取液減壓回收溶劑至近干，用35%甲醇制成2種不同質量濃度的上樣液（1.0、0.5 g/mL），以十八烷基鍵合硅膠反相填料（ODS）用量與上樣生藥量比為10∶1.5（g/g）上樣，以甲醇-水（35∶65，V/V）洗脫，每個柱體積收集1份洗脫液，按“2.1.10”項下方法測定。結果顯示，當上樣液濃度為1.0 g/mL時，由于溶液濃度高、黏度大，容易堵塞色譜柱，并且吸附速度較慢，可能造成死吸附；當上樣液濃度為0.5 g/mL時，訶黎勒酸、訶子酸累積洗脫量高于濃度為1.0 g/mL時訶黎勒酸和訶子酸累積洗脫量，故選擇上樣液濃度為0.5 g/mL。結果見圖3。

2.3.2 洗脫溶劑的考察 按“2.2.3”項下最佳提取工藝提取，將提取液減壓回收溶劑至近干，用20%甲醇制成質量濃度為0.5 g/mL的上樣液，以ODS與上樣生藥量比10∶1（g/g）上樣，以不同洗脫溶劑[洗脫溶劑Ⅰ為甲醇-水（1∶4→1∶3→3∶7，V/V），洗脫溶劑Ⅱ為甲醇-水（1∶4→3∶7，V/V）]洗脫，每個柱體積收集1份洗脫液，按“2.1.10”項下方法測定。結果顯示，以甲醇-水（1∶4→1∶3，V/V）洗脫時，得到的訶黎勒酸含量較低，且訶黎勒酸純度降低；以甲醇-水（1∶4→3∶7，V/V）洗脫時，得到的訶黎勒酸純度較高。因此以甲醇-水（1∶4，V/V）洗脫訶黎勒酸，甲醇-水（3∶7，V/V）洗脫訶子酸。結果見圖4。

2.3.3 ODS用量與上樣生藥量比值的考察 按“2.2.3”項下最佳提取工藝提取，將提取液減壓回收溶劑至近干，用20%甲醇制成質量濃度為0.5 g/mL的上樣液，分別以不同ODS用量與上樣生藥量比值（10∶1、10∶1.5、10∶2，g/g）上樣，以甲醇-水（1∶4，V/V）洗脫訶黎勒酸，甲醇-水（3∶7，V/V）洗脫訶子酸，每個柱體積收集1份洗脫液，按“2.1.10”項下方法測定。結果顯示，當ODS用量與上樣生藥量比值為10∶1（g/g）時，第1個柱體積雖有訶黎勒酸流出，但無訶子酸流出，表明此時色譜柱不超載；當ODS與上樣生藥量比值為10∶1.5（g/g）時，第1個柱體積只有極少量訶黎勒酸流出，表明此時色譜柱亦不超載；當ODS用量與上樣生藥量比值為10∶2（g/g）時，第1個柱體積除了有大量訶黎勒酸流出之外，還可檢測到少量的訶子酸，證明此時色譜柱已超載，故選擇ODS用量與上樣生藥量比值為10∶1.5（g/g）。結果見圖5。

2.3.4 訶黎勒酸、訶子酸的分離工藝驗證 取訶子粉末3 g，共3份，按“2.2.3”項下最佳提取工藝提取，將提取液減壓回收溶劑至近干，用20%甲醇制成質量濃度為0.5 g/mL的上樣液。取ODS 20 g，濕法裝柱，以初始流動相平衡后，取上樣液上樣，待液面下降至柱床頂部，以甲醇-水（1∶4，V/V）洗脫，收集第2～10個柱體積的流分得到訶黎勒酸，然后繼續甲醇-水（1∶4，V/V）洗脫至第17個柱體積后，改為甲醇-水（3∶7，V/V）洗脫，收集第2～5個柱體積的流分得到訶子酸。分別減壓回收溶劑，得到的產品經重結晶后按“2.1.10”項下方法測定，計算總得率，并采用面積歸一化法計算產品純度，平行測定3次。結果見表5。

表5 訶黎勒酸和訶子酸分離工藝驗證結果（n＝3）

3 討論

訶黎勒酸和訶子酸的分子結構中存在多個沒食子?；?，極性較強[14]，因此在提取過程中考察了不同體積分數乙醇為提取溶劑時對訶黎勒酸、訶子酸含量的影響。當乙醇體積分數為70%時，訶黎勒酸、訶子酸含量均較高。在確定提取溶劑的前提下對其他參數進行正交實驗，確定最佳提取工藝為70%乙醇超聲提取，粒徑120目，液料比25∶1（mL/g），提取時間20 min，提取次數2次。經3次實驗驗證，所得提取工藝重復性好，穩定性好，簡單可行。

在訶黎勒酸和訶子酸的分離過程中，根據訶黎勒酸和訶子酸的結構及性質，選擇ODS作為固定相，這有效避免了使用硅膠作為填料時對組分的死吸附，降低了訶黎勒酸、訶子酸的損失，提高了生產效率；反相色譜的流動相以水為底劑，減少了有機溶劑的使用，降低了對實驗人員的危害及環境污染，適用于訶黎勒酸和訶子酸的大量生產。在訶黎勒酸和訶子酸分離工藝參數的確定中，以高效液相色譜法進行檢測，最終確定以甲醇-水（1∶4，V/V）為初始洗脫劑，沖洗2個柱體積后大極性成分即可出柱完全，繼續收集1～9個柱體積的洗脫液可得到訶黎勒酸；再以甲醇-水（3∶7，V/V）洗脫，收集1～5個柱體積的洗脫液可得到訶子酸；當訶黎勒酸和訶子酸在洗脫液中的純度達到80%以上時，通過回收溶劑可得到結晶，經過重結晶即可制得訶黎勒酸及訶子酸純品。

綜上所述，所建立的訶黎勒酸和訶子酸的提取、分離工藝簡單可行。