非洲菊CAT2基因的克隆及表達

盧珍紅, 武 歡, 焦元辰, 張永艷, 李紳崇, 楊春梅, 程春振

(1.云南省農業科學院花卉研究所，云南 昆明 650100；2.玉溪云星生物科技有限公司，云南 玉溪 652604；3.福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002；4.山西農業大學園藝學院，山西 晉中 030801)

過氧化氫酶(catalase, CAT)又稱觸酶，可將組織中過多的H2O2歧化為H2O和O2，減少過氧化導致的細胞損傷[1].CAT與超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、抗壞血酸酶(APX)一起被稱為抗氧化酶保護系統.在植物中，抗氧化酶共同作用以維持氧化還原穩態[2].根據基因結構和序列特征，CAT可分為典型性CAT(單功能CAT)、非典型性CAT(錳CAT)和CAT-POD(雙功能CAT)3種類型[3].根據卟啉結構所含金屬離子的不同，又可分為鐵卟啉酶(包括典型性CAT、CAT-POD)和錳CAT(非典型性CAT，含有錳離子活性位點)兩類[4-5].此外，Willekens et al[6]基于煙草CAT基因的表達特征將其分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類.其中，Ⅰ類CAT在光合組織中強烈表達；Ⅱ類CAT在維管組織中表達最高；Ⅲ類CAT在種子和幼苗中顯著表達.

植物CAT主要位于過氧化物酶體、乙醛酸酶體和細胞質中.它通常由一個小基因家族編碼[7-8]，擬南芥[9]和煙草[10]均含有3個CAT基因成員，玉米有2個CAT基因成員[11]，棉花有7個CAT基因成員[12].CAT在植物防御應激反應、細胞氧化還原平衡和延緩衰老等方面發揮著重要作用，其表達具有一定的時空特異性[13-15].此外，眾多研究表明，CAT基因在植物響應逆境脅迫，如鹽脅迫[16]、干旱脅迫[17-18]、低溫脅迫[8,16]及抗病[19-21]等過程中發揮著重要作用.

非洲菊(Gerberajamesonii)是世界五大鮮切花之一，同時也是研究復雜花序發育與進化的模式植物[22].在鹽脅迫、干旱和寒冷等逆境下，非洲菊的生長及產量會受到嚴重抑制[23].根腐病是非洲菊的主要病害，可由隱地疫霉單獨引起[24]，現已成為制約非洲菊產業健康發展的重大難題.鑒于CAT基因在植物抗逆防御過程中的重要作用，本研究基于轉錄組數據克隆了一個非洲菊CAT基因，分析了其核苷酸和編碼蛋白序列特征，并檢測其在鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫處理以及接種根腐病病菌隱地疫霉后的表達水平，旨在為揭示該基因的功能及其在非洲菊抗逆育種中的應用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料處理

試驗材料‘玲瓏’非洲菊由云南省農業科學院花卉研究所提供.選取生長狀態良好的盛花期植株的花莖、花蕾、葉柄和葉片用于總RNA的提取.選取生長狀態良好、株高約為10 cm的幼苗進行逆境處理.其中，鹽脅迫(200 mmol·L-1NaCl)、聚乙二醇(polyethylene glycol， PEG)模擬干旱脅迫(30% PEG)和4 ℃低溫處理參照武歡等[25]和王星淇等[26]的方法，于處理0、4、8、12、24 h取葉；隱地疫霉接種參照郝向陽等[27]的方法，于處理0、2、4、6 d取根.所有樣品均設置3次生物學重復，取樣后立即置于液氮中速凍，之后置于冰箱(-80 ℃)中保存備用.

1.2 RNA提取及cDNA合成

利用Trizol RNA提取試劑盒[寶日醫生物技術(北京)有限公司]提取非洲菊總RNA.采用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄試劑盒[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]以oligo(dT)18作為反轉錄引物進行反轉錄合成cDNA第一鏈，用于基因全長克隆.qRT-PCR檢測所用不同處理的樣品cDNA使用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removel)試劑盒(全式金生物技術有限公司)以oligo(dT)18和隨機引物作為反轉錄引物合成.

1.3 CAT基因克隆及測序驗證

從非洲菊轉錄組數據中篩選獲得了一條具有完整開放閱讀框(ORF)的CAT基因序列(GenBank登錄號：MH708533)[28]，設計基因特異性引物(上游引物：TACATCAAGATCATGGAT；下游引物：TTCAATAGTTGGGGCGCAC)用于基因全長克隆.PCR反應體系(25 μL)包括12.5 μL Dream TaqTMGreen PCR Master Mix(2×)、9.5 μL ddH2O、1 μL cDNA、上下游引物各1 μL.PCR 擴增程序：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，34個循環；最后于72 ℃延伸10 min.所得PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后采用Gel/PCR Extraction Kit試劑盒回收目的片段，連接PMD18-T載體后轉化DH5α感受態，選取菌液PCR鑒定為陽性的克隆子送至福州鉑尚生物科技有限公司進行測序驗證.

1.4 生物信息學分析

參照郝向陽等[24]的方法，利用在線軟件分析非洲菊CAT2蛋白的基本理化性質、亞細胞定位、信號肽、跨膜結構、磷酸化位點和保守結構域.利用在線工具PSIPERD(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)和PHYRE2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/)分別對蛋白的二級結構和三級結構進行分析.從NCBI數據庫中檢索并下載其他物種CAT的氨基酸序列，使用MEGA-X中的ClustalW程序進行多序列比對.采用最大似然法(ML)構建系統進化樹.選擇LG模式，執行參數為完全刪除和1 000次重復.

1.5 非洲菊CAT基因表達水平的qRT-PCR檢測

以非洲菊18S rRNA為內參基因進行qRT-PCR檢測.以稀釋5倍的cDNA為模板，采用Roche Lighcycler 480熒光定量PCR儀進行相對表達水平的檢測.qRT-PCR擴增程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共50個循環.qRT-PCR反應體系：10 μL SYBR Premix Ex TaqTM熒光染料[寶日醫生物技術(北京)有限公司]、7.4 μL ddH2O、上下游引物(上游引物:CATTCTGGCTTGACGACA；下游引物:TGGCGTGGCTGTGATTAG)各0.8 μL、1 μL模板.使用2-ΔΔCT法計算CAT2基因在不同處理下的相對表達量.利用SPSS軟件分析不同樣品在1%水平上的差異顯著性，并使用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖.

2 結果與分析

2.1 CAT基因的克隆及序列

M：DL5000 marker.圖1 擴增產物電泳檢測圖譜Fig.1 Electrophoresis gel of amplified products

成功地從“玲瓏”非洲菊中克隆獲得了一條1 490 bp的基因序列(圖1).序列分析顯示，該基因編碼序列(coding sequence， CDS)的長度為1 479 bp，預測可編碼492個氨基酸.Blastn比對結果顯示，該基因與刺苞菜薊(Cynaracardunculus)CAT2基因(XM_025133682.1)的相似度最高，為88.00%，故將其命名為GjCAT2.

2.2 GjCAT2編碼蛋白的基本理化性質

蛋白理化性質分析顯示，GjCAT2編碼蛋白的分子質量為56.854 ku，分子式為C2558H3874N714O734S15，原子總數為7 895，等電點為6.5，脂肪系數為71.73，為穩定親水蛋白.該蛋白由20種氨基酸組成，以天冬氨酸占比最高，約占7.3%，含有61個帶正電荷殘基(精氨酸+賴氨酸)和56個帶負電荷殘基(天冬氨酸+谷氨酸).蛋白保守結構域預測(圖2)顯示，該蛋白含有典型的CAT保守結構域PLN02609(位于第6～492位)和7個血紅素結合位點(65H、104S、138N、143F、151F、344R、348Y)[3]，說明其屬于過氧化物酶超家族和KatE超家族[30-31].二級結構預測(圖3A)顯示，該蛋白由26.02% α-螺旋、10.98% β-折疊、43.90%不規則卷曲和19.11%延伸鏈組成.該蛋白無跨膜結構及信號肽，推測屬于非分泌性蛋白.磷酸化位點預測顯示，該蛋白僅有4個磷酸化位點：位于第18位的酪氨酸，第7位的蘇氨酸，第19、23位的絲氨酸.亞細胞定位預測顯示，該蛋白主要定位于過氧化物酶體.保守序列分析顯示，該蛋白具有CAT活性基序(CAM, FHRERIPERIVHARGAS)和CAT血紅素結合位點(HBS, RVFAYGDAQ)[29].三級結構預測(圖3B)顯示，該蛋白含有4個亞基，由此進一步推測GjCAT2為典型性CAT[4].

圖2 GjCAT2保守結構域預測結果Fig.2 Predicted conserved domain of GjCAT2

A：二級結構；B:三級結構.圖3 GjCAT2二級結構和三級結構預測結果Fig.3 Predicted secondary and tertiary structures of GjCAT2

2.3 蛋白序列比對及聚類分析

蛋白序列比對(圖4)顯示：GjCAT2與刺苞菜薊CAT的同源相似性最高，達96.95%；與向日葵、薇甘菊CAT的同源相似性分別為95.93%和94.11%.系統進化樹共分為兩個分支：GjCAT2與萵苣、刺苞菜薊、向日葵等菊科植物CAT聚在一支，其他物種CAT聚在另一支(圖5).

紅線標識為CAT活性基序(CAM)和血紅素結合位點(HBC).圖4 不同植物CAT 蛋白序列多重比對結果Fig.4 Multiple alignment of CAT protein sequences from different plants

2.4 GjCAT2基因在非洲菊不同組織器官中及在不同非生物逆境處理下的表達水平

圖6顯示，GjCAT2基因在非洲菊正常健康植株不同組織器官中的表達水平存在顯著差異.GjCAT2基因在花莖中的相對表達量最高，葉柄次之，葉最低；在花莖中的相對表達量顯著高于葉、葉柄和花蕾，分別是葉、葉柄和花蕾的31.82、7.48和10.75倍.

圖5 不同植物CAT系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of CAT proteins from different plants

圖7a顯示，鹽脅迫處理下，GjCAT2基因的表達量呈“降—升—降—升”的趨勢.GjCAT2基因在處理4 h的表達受到極顯著抑制；處理8 h的相對表達量驟升達到峰值，為CK的3.48倍；隨后于處理12 h急劇下降至與CK相近；處理24 h再次升高，相對表達量約為CK的2.66倍.

圖7b顯示，PEG模擬干旱處理后，GjCAT2基因的表達量呈“升—降—升”的趨勢.GjCAT2基因在處理4 h的表達受到誘導；之后顯著下降，并于處理12 h降到最低，相對表達量僅為CK的33.12%；處理24 h的相對表達量回升，與CK基本持平.

圖7c顯示，4 ℃低溫處理下，GjCAT2基因的表達在脅迫前期受到顯著誘導，處理8 h的相對表達量達到峰值，為CK的2.31倍；處理12 h的相對表達量僅為CK的18.00%；而處理24 h的相對表達量又恢復至與CK相近.

圖7d顯示，接種隱地疫霉后，GjCAT2基因的表達在處理2和4 d均受到極顯著抑制，但處理6 d的相對表達量驟升為CK的3.11倍.

a：鹽脅迫處理；b：PEG模擬干旱處理；c：4 ℃低溫處理；d：隱地疫霉接種處理.圖柱上附不同字母表示差異極顯著(P<0.01).圖7 不同脅迫處理對GjCAT2基因表達水平的影響Fig.7 Effect of different stress treatments on relative expression of GjCAT2 gene

3 討論

本研究成功地從‘玲瓏’非洲菊克隆獲得了一個CAT基因(GjCAT2)，該基因序列與刺苞菜薊CAT2基因的相似度高達88.00%.其編碼蛋白預測定位于過氧化物酶體，具有典型性CAT2保守結構域和血紅素結合位點，且屬于KatE超家族，推測該蛋白為典型性CAT.此外，根據GjCAT2基因在非洲菊不同組織器官中的表達水平(花莖>葉柄>花蕾>葉)，推測GjCAT2屬于Ⅱ類CAT.

多數CAT基因具有明顯的時空特異性.辣椒CAT基因在莖中的表達水平顯著高于葉和根，且在果實發育早期比成熟期更為豐富[20]；黃瓜CAT2基因則在莖、葉、花和果實中表現出更高的轉錄水平[13]；煙草CAT2基因在花中的表達量最高[27]；而水稻CATA基因和棉花CAT1～CAT4基因在所有發育階段都表現出較高的表達水平[12,32].本研究結果表明，GjCAT2基因在非洲菊花莖中的表達量極顯著高于其他組織器官，說明其具有Ⅱ類CAT基因的典型表達模式，在維管組織中的表達量較高.

CAT是一種重要的活性氧清除酶，在植物生長、發育和非生物脅迫響應中起著至關重要的作用[33-34].在鹽脅迫條件下，油菜CAT基因家族成員和黃瓜CAT基因均有不同程度的上調表達[35-36]；甘薯在200 mmol·L-1NaCl處理2和11 d時，幼葉中CAT2基因的表達量分別比CK上調了72.74和352.48倍，在膨脹塊根中的表達量同樣在處理11 d時達到最大值[14].本研究結果表明，GjCAT2基因在NaCl處理4 h時，其表達受到極顯著抑制，而在處理8和24 h時的相對表達量又出現了不同程度的上升，分別為CK的3.48和2.66倍，說明GjCAT2基因在鹽脅迫下被兩次誘導，進而在非洲菊抗鹽反應中發揮作用.

研究表明：水稻CATA和CATC基因的過表達是通過被耐鹽受體樣細胞質激酶磷酸化和激活，進而提高了轉基因水稻的耐旱性[37]；甘蔗CAT1基因在25% PEG處理下被顯著誘導[38].本研究結果表明，GjCAT2基因的表達在PEG模擬干旱脅迫初期受到顯著誘導，其表達水平于處理8 h時達到峰值，處理12 h時驟然下降，但處理24 h時又出現回升，表明GjCAT2基因在非洲菊早期抵御干旱過程中發揮的作用更大.

大量研究表明，CAT基因的表達豐度可在脅迫開始時顯著上調[8,39-40].13 ℃低溫處理下，水稻CAT活性顯著提高，CATB基因的表達受到顯著誘導，CAT活性與CATB基因的表達呈正相關[41].本研究中，GjCAT2基因的表達受4 ℃低溫脅迫誘導顯著，其相對表達量于處理8 h時達到峰值，為CK的2.31倍，暗示著GjCAT2基因參與非洲菊早期低溫應答.

CAT在植物抗病過程中也發揮著重要作用.棉花在受大麗花弧菌感染后，CAT基因家族均受顯著誘導[12]；煙草在接種煙草病原菌后，瞬時過表達CAT2基因的葉片表現出較輕的病狀[19]；而擬南芥CAT2敲除突變體中含更多的H2O2，表明CAT2是清除活性氧的關鍵酶之一.本研究中，接種隱地疫霉早期(2、4 d)，GjCAT2基因的表達受到極顯著抑制，處理6 d的相對表達量顯著升高，為CK的3.11倍.GjCAT2基因的表達在感病前期被顯著抑制可能與病原菌侵染有關，表達量在接種隱地疫霉6 d后才開始上調，說明此時非洲菊根系已經受到顯著的氧化脅迫.GjCAT2基因表達量的增加有助于清除由病原菌刺激產生的H2O2，在抵御根腐病過程中發揮著重要作用.

4 結論

本研究成功地從‘玲瓏’非洲菊克隆獲得了一個CDS長度為1 479 bp的GjCAT2基因，其編碼蛋白具有典型性CAT保守結構域和血紅素結合位點，是屬于KatE超家族的典型性CAT.根據GjCAT2基因在花莖中高水平的表達特征，推測其屬于Ⅱ類CAT基因.此外，GjCAT2基因的表達受鹽脅迫、干旱、低溫和隱地疫霉的影響顯著，推測其可能在非洲菊抵御這些逆境中扮演著重要角色.