羥基磷灰石/氧化石墨烯(HAP/GO)的可控合成及其用于布洛芬的緩釋

宋芊，高海清，王應席，李玲

(湖北高級有機化工材料協同創新中心，教育部有機合成與應用重點實驗室，湖北大學化學化工學院，湖北 武漢430062)

0 引言

近年來，羥基磷灰石(HAP，Ca10(PO4)6(OH)2)作為一種藥物載體逐漸受到人們的關注[1].由于HAP具有無毒、生物相容性好和比表面積大的優勢，它已被廣泛用作各種藥物的藥物儲存/釋放系統中的載體.與傳統的藥物載體不同的是，HAP材料具有高比表面積和羥基，可以與適合的藥物官能團反應，因此能夠負載和釋放藥物分子[2].然而，HAP作為藥物載體，載藥量不高，并在早期總是存在藥物突釋的問題，在治療部位難以形成平穩、有效的藥物濃度，導致HAP的應用受到限制.為達到良好的藥物緩釋效果，可以將HAP與其他材料形成復合材料.

GO(氧化石墨烯(GO))是一種具有二維蜂窩結構的新型納米材料[3]，以其優異的力學、熱學、電學和光學性能引起了眾多學者的關注[4-5].近年來，在生物醫學應用[6]，特別是生物靶向和藥物遞送方面的探索取得了一定的成果[7-8].有研究者采用聚乙烯納米載體通過非共價物理吸附作用來加載抗癌藥物[9-10].也有研究者發現，抗癌藥物鹽酸阿霉素負載在氧化石墨烯上，負載藥物與載體的負載重量比高達200%[11].此外，氧化石墨烯具有許多羧基、羥基和環氧基團，可以增加與藥物分子之間的作用，從而達到緩釋的目的.

基于GO的優勢[12]，將其添加到HAP中形成HAP/GO的混合體，有望提高HAP的載藥量.由于GO有大量的羥基、羧基等親水性官能團[13-14]，能與HAP配位且能與布洛芬氫鍵[15]結合.因此，HAP/GO復合材料有望作為藥物緩釋材料.本研究中，合成了HAP和GO的復合材料HAP/GO，選擇IBU(布洛芬)作為藥物模型，比較相同條件下HAP和HAP/GO的載藥量和釋藥量，考察HAP/GO作為布洛芬緩釋材料的基本性能.

1 實驗部分

1.1 材料與方法雞蛋殼收集于學校食堂，清洗干凈后，小心的把雞蛋殼內膜剝下，60 ℃烘干48 h，將雞蛋殼于碾磨機中碾成粉末，備用.石墨，布洛芬為阿拉丁試劑，環己烷、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、NH4H2PO4均為國藥制藥廠試劑，所有試劑均為分析純，實驗用水為二次去離子水.

JSM6510LV掃描電子顯微鏡(JEOL,Japan)獲得掃描電子顯微鏡圖像；D/max-IIIC X線衍射儀(Rigaku,Japan)測試粉末X線衍射(XRD)；單頻紅外分光光度計(PerkinElmer,USA)獲取傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜；比表面積通過使用BET(BrunauereEmmeteTeller)在77 K(Belsorp-max)下的N2物理吸附結果計算.

1.2 HAP的制備對文獻報道的HAP制備方法[16]進行了一些修改，制備方法具體如下：將0.3 g蛋殼粉末加入25 mL 0.1 g/mL NH4H2PO4溶液中，轉移至聚四氟乙烯反應釜中，放入烘箱中，120 ℃加熱24 h.冷卻至室溫后，通過離心分離反應產物，并用蒸餾水和無水乙醇交替洗滌3次，然后在60 ℃下干燥24 h，得到HAP.

1.3 HAP/GO的制備GO是通過改進的hummer方法制備的[13].HAP/GO的合成如圖1所示.10%和20%GO分別加入到0.1 g/mL NH4H2PO4溶液中超聲分散中.將0.3 g雞蛋殼粉末加入到上述混入了GO的25 mL NH4H2PO4溶液中，轉移至聚四氟乙烯反應釜中，放入烘箱中，120 ℃加熱24 h.冷卻至室溫后，通過離心分離反應產物，并用蒸餾水和無水乙醇交替洗滌3次，然后在60 ℃下干燥24 h,得到HAP/GO.

1.4 IBU的負載實驗將布洛芬(IBU，50 mg)先溶解在環己烷(50 mL)中，然后加入HAP(500 mg).將混合物密封后在室溫下靜置72 h，取上清液在260 nm波長下通過UV-vis光譜分析.IBU的校準曲線是通過吸光度與IBU濃度的關系確定的.對于此區間，校準曲線遵循Beer-Lambert定律：

A=1.27C+0.007 5

其中A是吸光度，C是IBU濃度(mg/mL).

吸附了IBU的HAP經離心分離后，60 ℃真空干燥，用于藥物釋放測定.HAP/GO雜化材料的IBU負載實驗按相同方法操作.

1.5 藥物釋放將負載IBU的HAP裝入透析袋，將Na2HPO4·12H2O溶液(0.2 mol/L)和檸檬酸溶液(0.1 mol/L)按體積比(pH=7.4)設置緩沖溶液(PBS).加入1.5 ml緩沖溶液后密封透析袋.然后置于20 mL的PBS(pH=7.4)溶液中，將樣品于恒溫搖床中輕輕搖動，設定溫度為37 ℃.每隔一段時間，取出3 mL溶液，以在264 nm處測其吸光度，并補充相同體積的新鮮PBS緩沖溶液代替.HAP/GO雜化材料的藥物釋放實驗按相同方法操作.

2 結果與討論

2.1 HAP和HAP/GO的表征HAP和HAP/GO的XRD如圖2所示.33.5°、32.0°、31.8°、30.11°、29.60°和28.94°的峰分別對應于HAP的(202)、(300)、(211)、(121)、(002)和(101)衍射面.HAP的特征衍射峰保留在HAP/GO中，這表明雜化材料中保留HAP的基本晶體結構.然而，HAP與HAP/GO雜化材料在10°～20°之間衍射峰明顯有區別，說明GO的加入對材料的結構有影響.

HAP與HAP/GO的紅外表征如圖3所示.3 400 cm-1處為GO中羥基的特征峰，1 703 cm-1處為GO中—COOH中C—O的伸縮振動峰(黑線).980 cm-1處是PO43-的對稱伸縮峰，1 110 cm-1和1 037 cm-1的峰為PO43-的振動峰，而603 cm-1和566 cm-1的峰為PO43-的彎曲峰(紅線)，這些HAP的特征峰在HAP/GO中也可以觀察到，說明雜化材料HAP/GO中基本保留了HAP的基本晶體結構.但在3 000 cm-1～ 4 000 cm-1范圍內，HAP與HAP/GO的峰值區別較大.并且，當GO含量較高時，雜化材料中GO的特征峰變得更強.說明了GO的加入對雜化材料有影響.值得注意的是，1 703 cm-1處屬于—COOH的峰在雜化材料中很弱，很難觀察到.這是由于雜化材料中，GO的—COOH與HAP之間存在相互作用.

HAP和HAP/GO的SEM圖像如圖4所示.HAP/GO和HAP的形狀特征完全不同，HAP是大小均勻的胡須形狀.在10%GO的HAP/GO中，結構就像花一樣，表明該材料不是HAP和GO簡單摻雜，而是新材料的形成.含有20% GO的HAP/GO看起來像帶有鱗片聚集的花，這與含有10% GO的HAP/GO的形狀不同.進一步證明GO的量對結構有很大影響.圖5顯示了HAP和HAP/GO的N2吸附-解吸等溫線和孔徑分布.可以看出，所有材料在低壓區都有一定的吸附能力，而在中高壓區有磁滯回線，均顯示I/IV混合型等溫線.根據孔徑分布曲線，在4 nm和20 nm處可以觀察到明顯的介孔分布，如圖5(b)所示.添加GO后，在4 nm、6 nm和約10 nm處可觀察到明顯的介孔分布，如圖5(d)所示.可以解釋為GO填充了HAP的部分孔隙，形成了雜化材料，從而引起孔徑分布發生了變化.但是，當GO的含量過多時，GO很容易聚合在一起，導致孔徑分布不是那么清楚，如圖5(f)所示.結論與SEM圖像一致.

通過N2吸附-解吸等溫線計算的相應結構參數如表1所示.HAP的BET表面積和孔體積分別為575 m2·g-1和0.39 cm3·g-1，遠低于HAP/GO表面積1 214 m2·g-1和孔體積0.61 cm3·g-1.HAP/GO的孔徑要小得多.因此，適量的GO的加入對HAP的結構有很大的影響，大大增加了表面積、孔容和更小的孔徑，這些都是促成優異吸附性能的積極因素.

表1 (a) HAP, (b) HAP/GO (10%) 和(c) HAP/GO (20%) 的孔隙率分析

2.2 IBU的負載和緩釋的應用HAP與HAP/GO的IBU載藥量比較如圖6所示.可以看出，GO含量為10%的HAP/GO雜化材料載藥量最高.這可能是由GO結構中的羥基、羧基等基團引起的.IBU結構也有羥基，這些基團可以與雜化分子的GO形成氫鍵.因此，雜化材料對布洛芬有更高的載藥量.并且含有20%GO的HAP/GO的載藥量甚至低于HAP，這表明GO的量在雜化材料中非常重要.GO的適量加入可以提高載藥量，但如果GO量過多，會因為GO的聚集從而削弱材料的載藥量.

HAP/GO雜化材料在144 h內的藥物釋放如圖7所示，插入圖為5 h內的釋放.HAP和HAP/GO(10% GO)在5 h內釋放量分別為48%和40%.HAP/GO(20% GO)在5 h內釋放量約35%.可以看出，在前5 h，HAP/GO(20% GO)布洛芬的釋放量最低.

然而，HAP在24 h后表現出75%的釋放，然后在120 h后緩慢釋放.HAP/GO(20% GO)在24 h內釋放75%，然后在120 h后緩慢釋放.而HAP/GO(10% GO)在24 h內表現出約60%的突然釋放，隨后釋放相對緩慢，144 h后完全釋放.可以得出結論，HAP/GO(10% GO)的藥物緩釋的效果最好.

多孔材料的吸附有不同的吸附作用.物理吸附會使吸附的藥物分子容易發生解吸附，導致迅速釋放，難以符合藥物緩釋的要求.GO有很多羧基和羥基，而IBU也有羧基，因此HAP/GO和IBU之間形成氫鍵.因此，HAP/GO雜化材料中的藥物分子IBU釋放更慢，說明適當添加GO不僅可以提高載藥量，而且可以達到更好的給藥效果.然而，當GO的量不斷增加時，GO可能會聚集并填充HAP的孔隙，這將導致吸附減少和藥物釋放效果變差.

據此，推測了雜化材料的形成機理[17]，如圖8所示.

也可以解釋為，當GO含量增加時，結構更加聚集.—COOH基團和—OH基團可以相互作用，然后在雜化材料中發生GO的聚集.

3 結論

本研究中，以雞蛋殼為原料，加入GO，成功合成并表征了HAP和HAP/GO雜化材料.表征結果表明，含有10% GO的HAP/GO具有優良的花狀結構.還進行了IBU負載和釋放實驗.結果表明，含有10% GO的HAP/GO具有最佳性能.GO的含量在雜化材料的形成中非常重要，對結構和性質有影響.GO的適當加入不僅可以提高載藥量，而且可以實現更好的緩釋.