不同品種獼猴桃果實采后糖酸組分及含量變化分析

毛積鵬， 高 柱,， 盧玉鵬， 陳 璐， 張小麗， 王小玲*

(1.江西省科學院 生物資源研究所， 江西 南昌 330096； 2.井岡山生物技術研究院， 江西 吉安 343016)

0 引言

獼猴桃(Actinidia spp.)是20世紀由野生到人工商業化栽培馴化最為成功的果樹種類之一，富含維生素、礦物質、氨基酸、有機酸等對人體健康有益的代謝產物，因其獨特的風味，已成為世界上最受歡迎的水果之一[1-4].中國是獼猴桃的原產國，同時也是全球最大的獼猴桃種植國家，種植區主要分布在陜西、四川、云南、貴州、江西等地，是適種地區農民脫貧致富的支柱產業[5].雖然全球范圍內中國獼猴桃的產量穩居第一，年產量300萬噸以上，但表觀消費量均值僅230萬噸左右，加工比例僅10%，貯藏比例不足20%.采后腐爛率高達20%～30%，商品化率小于60%，即買即食率10%以下[6].究其原因，主要是我國獼猴桃產業采后保鮮和品質提升技術落后、重采前輕采后等產業問題突出，從而影響了消費者口碑和市場競爭力[7].

可溶性糖作為水果風味的重要組成部分，在果實品質形成中扮演著重要的角色.果實中可溶性糖主要為蔗糖、果糖和葡萄糖，不同園藝作物或不同發育和成熟階段果實的優勢糖組分差異顯著[8].例如，柑橘主要糖組分是蔗糖[9]，蘋果主要糖組分是果糖[10].有機酸也是決定水果風味的主要成分之一，在維持水果品質和營養價值方面起著重要的作用.水果中含有多種有機酸，但大多數水果只以其中一種或幾種為主.例如，柑橘、草莓和菠蘿等水果中的主要有機酸為檸檬酸；蘋果、枇杷和梨等水果中的主要有機酸為蘋果酸；獼猴桃中的主要有機酸則為奎寧酸和檸檬酸[11-13].

不同種類的獼猴桃在口感和營養品質方面存在較大的差異[14-16].本研究以我國選育的世界首個紅肉品種“紅陽”獼猴桃、首個實現商業化栽培的種間雜交品種“金艷”獼猴桃和新西蘭“金果”獼猴桃三種風味差異較大的中華獼猴桃果實為研究材料，采用氣相色譜-質譜聯用(GC-MS)和液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)技術方法對三種獼猴桃果實的可溶性糖和有機酸酸組分及其含量進行測定與分析.旨在為中華獼猴桃品種品質的評價及采后品質提升技術的開發提供一定的理論基礎.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

分別于2021年的8月、9月和10月從江西省奉新縣江西省科學院博士獼猴桃基地(E 114°45′，N 28°34′)采取供試的“紅陽”、“金果”和“金艷”獼猴桃果實.每個品種隨機選取30個大小均一的健康果實，運回實驗室后選取15個果實去皮、去籽，冷凍干燥磨粉后于-80 ℃保存備用，其余15個室溫放置軟熟后(硬度0.8～1 kg/cm2)進行取樣.每5個果實混合為一份樣本，共3個生物學重復.

色譜級甲醇，異丙醇，乙腈，Merc公司；色譜級正己烷，標準品，德國CNW公司；色譜級甲酸，99%純度的甲氧胺鹽，吡啶和N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA),Sigma公司.

1.2 主要儀器

LC-MS/MS(OTRAP6500+)美國SCIEX公司；GC-MS(7890-5975C)美國Agilent公司；離心機(5424R)德國Eppendorf公司；球磨儀(MM400)德國Retsch公司；冷凍干燥機(Centri Vap)美國Labconco公司；多管渦旋振蕩器(Mix-200)上海凈信科技有限公司；超聲清洗儀(KQ5200E)昆山舒美超聲儀器公司；氮吹儀(XD-DCY-24Y)上海析達儀器有限公司.

1.3 實驗方法

1.3.1 可溶性糖組分測定

樣本制備參考Sun等[17]的方法進行改進，具體操作步驟如下:稱取20 mg粉末樣本于2 mL離心管中，加入500 μL提取液(甲醇∶異丙醇∶水，3∶3∶2)，渦旋3 min， 冰水中超聲30 min，4 ℃，14 000 r/min離心5 min；轉移50 μL上清液至另一個干凈的1.5 mL離心管中，并加入20 μL濃度為100 μg/mL的核糖醇內標溶液，氮吹并冷凍干燥后加入100 μL濃度為15 mg/mL的甲氧銨鹽吡啶，37 ℃孵育2 h；隨后加入100 μL的BSTFA，37 ℃孵育30 min得到衍生化溶液，取50 μL的衍生化溶液用正己烷稀釋至1 mL，保存于棕色進樣瓶中，用于GC-MS分析.

色譜主要條件：色譜柱為HP-5MS(30 m×0.25 mm × 0.25 μm),載氣為氦氣，不分流.程序升溫條件：70 ℃ 保持1 min， 隨后以30 ℃/min升溫至112 ℃，再分別以15 ℃/min升溫至175 ℃，3 ℃/min升溫至190 ℃，35 ℃/min升溫至240 ℃，10 ℃/min升溫至280 ℃，傳輸線溫度240 ℃，進樣量為2 μL.質譜主要條件：溶劑切割時間為5.5 min離子源溫度為230 ℃，電離電壓為70 eV，以分辨率70 000進行全掃描，掃描范圍為81～1 000 m/z，掃描周期為0.2 s

1.3.2 有機酸組分測定

稱取50 mg粉末樣本于2 mL離心管中，立即加入500 μL提前-20 ℃預冷的甲醇提取液，渦旋3 min.4 ℃條件下，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液300 μL于1.5 mL離心管中，-20 ℃靜置30 min，4 ℃條件下，再12 000 r/min離心10 min，取上清液200 μL于進樣瓶中-20 ℃保存用于UPLC-MS/MS分析.

液相主要條件：色譜柱為ACQUITY HSS T3 (1.8 μm,100 mm×2.1 mm )，流動相A相，超純水(0.05%甲酸)，B相，乙腈(0.05%甲酸).梯度洗脫程序為0 min A/B為95∶5(V∶V),8～9.5 min A/B為5∶95，9.6～12 min A/B為95∶5，流速為0.35 ml/min，柱溫40 ℃，進樣量2 μL.質譜主要條件為：電噴霧離子源溫度550 ℃，正離子模式下質譜電壓5 500 V,負離子模式下質譜電壓-4 500 V，氣簾氣為35 psi.

1.4 數據處理

通過 Proteowizard 軟件(V.3.0.8789)將獲得的原始數據轉換成 mzXML 格式，隨后利用 R(V.3.3.2)的 XCMS 程序包進行峰識別、峰過濾和峰對齊分析，利用Aglient Masshunte軟件進行積分峰匹配.采用MultiQuant 3.0.3軟件處理質譜數據，參考標準品的保留時間與峰型信息進行積分校正與定性分析，通過標準曲線對檢出目標物進行定量分析.t檢驗用于含量差異顯著性分析，采用Z-Score法進行數據歸一化處理并利用MeV 4.8.1軟件進行聚類分析.

2 結果與討論

2.1 總離子流色譜圖分析

獼猴桃果實可溶性糖和有機酸檢測樣本的總離子流色譜圖分別如圖1和圖2所示.結果表明，可溶性糖和有機酸檢測總離子流的曲線重疊性高，保留時間和峰強度高度一致，儀器穩定性高，檢測結果可靠.可溶糖的出峰時間在11～25 min之間，有機酸的出峰時間0.5～5.0 min之間.可溶性糖和有機酸標準曲線的線性回歸方程相關系數分別介于0.992～0.999和0.991～0.999之間(線性方程數據未列出).表明在設定的高效液相色譜條件下各種可溶性糖和有機酸組分的峰面積與其含量有較好的線性相關性.

圖1 基于GC-MS分析的獼猴桃可溶性糖總離子流色譜圖

圖2 基于UPLC-MS/MS分析的獼猴桃有機酸總離子流色譜圖

2.2 可溶性糖組分及含量差異分析

通過標樣驗證在3種獼猴桃果實中共鑒定到12種可溶性糖，主要為蔗糖、果糖和葡萄糖(如表1所示)，這和其它果實中的主要可溶性糖組分基本一致[9,10,18].蔗糖、果糖和葡萄糖在3種獼猴桃軟熟期的含量均極顯著高于采收期(如表1所示).

表1 不同獼猴桃品種果實采收和軟熟期可溶性糖組分及平均含量 (mg/g)

在采收期，蔗糖在“紅陽”中含量略高于“金果”和“金艷”，葡萄糖在“金果”中的含量略高于“金艷”，而極顯著高于“紅陽”(p<0.001).果糖在“金果”和“金艷”中的含量無明顯差異，但均高于“紅陽”.在相應獼猴桃的軟熟期，蔗糖在“金艷”中的含量高于“紅陽”和“金果”，葡萄糖在“金果”中的含量高于“紅陽”和“金艷”，這與采收期的結果一致；果糖在“金果”中的含量最高，但在“紅陽”和“金艷”中的含量無明顯差異(p>0.05).初步表明“紅陽”果糖的積累可能主要發生在采后軟熟過程中，采收期果糖含量只有17.623 mg/g，到而軟熟期果糖含量高達 72.454 mg/g，其含量增加了4.11倍.

肌醇在3種獼猴桃軟熟期的含量均低于采收期.海藻糖、阿拉伯糖和山梨醇在3種獼猴桃軟熟期的含量均略高于采收期，與3種主要可溶性糖含量的變化結果一致.麥芽糖、半乳糖和鼠李糖在“紅陽”和“金艷”軟熟期的含量均高于采收期(如表1所示)，在“金果”軟熟期的含量則低于采收期.巖藻糖和木糖醇分別只在“紅陽”和“金果”獼猴桃的軟熟期被檢測到.一種可能是巖藻糖和木糖醇分別在“紅陽”和“金果”獼猴桃果實軟化過程中才開始被逐漸合成.另一種可能則是這兩種糖在對應獼猴桃果實采收期的含量低于GC-MS的檢測下限.

2.3 有機酸組分及含量差異分析

在三種獼猴桃果實中共鑒定到31種有機酸，主要為奎寧酸、檸檬酸和蘋果酸，其次是順式-烏頭酸、丙酮酸和泛酸(如表2所示).這與其它獼猴桃品種果實中有機酸的主要成分基本一致[15].“紅陽”和“金果”中含量最高的是奎寧酸，其次是檸檬酸和蘋果酸，而“金艷”采收期含量最高的是檸檬酸，軟熟期含量最高的是奎寧酸.奎寧酸的含量在3種獼猴桃的采收期和軟熟期無明顯差異(p>0.05)；檸檬酸在3種獼猴桃軟熟期的含量均顯著高于采收期(如表2所示)；蘋果酸在“紅陽”軟熟期的含量低于采收期，在“金果”軟熟期的含量高于采收期，在“金艷”軟熟期和采收期的含量則基本一致.這初步表明，檸檬酸降解可能是這三種獼猴桃果實采后酸度下降的主要因素.

表2 不同獼猴桃品種果實采收期和軟熟期有機酸組分及平均含量 (μg/g)

順式-烏頭酸和泛酸在“紅陽”軟熟期和采收期的含量無顯著差異，在“金果”軟熟期和含量顯著低于采收期，在“金艷”軟熟期的含量則顯著高于采收期(如表2所示).反式-烏頭酸在“紅陽”軟熟期和采收期的含量無明顯差異，在“金果”和“金艷”獼猴桃軟熟期的含量則顯著低于采收期(如表2所示).隱綠原酸和新綠原酸在“紅陽”和“金艷”軟熟期的含量高于采收期，在“金果”獼猴桃軟熟期的含量則低于采收期.齊墩果酸在“紅陽”軟熟期的含量顯著低于采收期，在“金果”和“金艷”軟熟期的含量顯著高于采收期.琥珀酸在“紅陽”獼猴桃軟熟期的含量顯著高于采收期.酒石酸在“金果”和“金艷”軟熟期的含量顯著高于采收期，在“紅陽”軟熟期的含量顯著低于采收期.戊二酸、沒食子酸、甲基丁二酸、壬二酸、葵二酸和辛二酸在“紅陽”和“金果”軟熟期的含量均低于采收期，而在“金艷”軟熟期的含量則均高于采收期.

肉桂酸只在“金艷”的軟熟期被檢測到，含量為148.865 μg/g.阿魏酸則只在“金果”的軟熟期和“金艷”的采收期被檢測到，其含量分別為0.039 μg/g和0.029 μg/g.丙酮酸、苯甲酸、水楊酸、莽草酸和?；撬嵩?種獼猴桃軟熟期和采收期的含量無明顯差異.以上初步表明，不同品種獼猴桃果實有機酸組分基本一致，但各組分的含量有明顯差異.

2.4 糖酸比與聚類分析

除糖酸組分外，糖酸比(總糖/總酸)在很大程度上決定了果實風味.由表1和表2分析可得，軟熟期“紅陽”、“金果”和“金艷”獼猴桃的糖酸比值分別為11.36、9.7和10.9，雖然“金果”獼猴桃的總糖含量最高，但受有機酸含量的影響，其甜度最低.

對12種可溶性糖和含量較高的19種有機酸的含量數據歸一化處理后分別進行聚類分析.結果表明：“紅陽”、“金果”和“金艷”三種獼猴桃的可溶性糖和有機酸含量分別在采收期和軟熟期被直觀地聚類為兩組(如圖3所示).綜合表明，三個品種的獼猴桃果實在采后軟熟過程中的可溶性糖和有機酸的變化趨勢是基本一致的.

圖3 三種獼猴桃可溶性糖和有機酸含量的聚類熱圖分析( JY、JG和HY分別表示“金艷”、“金果”和“紅陽”；1、2分別表示采收期和軟熟期)

3 結論

本研究利用基于GC-MS和UPLC-MS/MS技術平臺的代謝組學方法對“紅陽”、“金果”和“金艷”三個品種獼猴桃果實采收期和軟熟期的可溶性糖和有機酸組分進行測定與分析，結果共鑒定到12種可溶性糖和31種有機酸.采收期三種獼猴桃果實的蔗糖、果糖和葡萄糖含量無明顯差異，軟熟期則以葡萄糖和果糖為主.“紅陽”和“金果”獼猴桃采收期和軟熟期的有機酸均以奎寧酸為主，“金艷”獼猴桃采收期以檸檬酸為主，軟熟期以奎寧酸為主.奎寧酸和蘋果酸在三種獼猴桃果實軟熟期和采收期的含量差異不顯著，檸檬酸是影響獼猴桃果實采后酸度的重要因素.糖酸比分析結果表明“紅陽”最甜，“金艷”適中，“金果”風味較淡.聚類分析結果表明三種獼猴桃的糖酸組分及采后的變化趨勢基本一致，但各組分的含量差異明顯.