花生芽白藜蘆醇超聲-微波協同提取及其抗氧化活性研究

王娜 寧燦燦 趙楠雨李娜李軍偉鄭玉茹趙崢余秋穎*

(1.河南農業大學食品科學技術學院,河南 鄭州 450002;2.鄭州市營養與健康食品重點實驗室,河南 鄭州 450002;3.農業農村部大宗糧食加工重點實驗室,河南 鄭州 450002)

花生芽是花生萌發后生成的一種食療兼備的食品,也叫長壽芽。其營養豐富,口感清脆,深受消費者的青睞[1]。經研究發現,花生在發芽過程中蛋白質降解為肽和氨基酸,脂肪含量迅速降低,其生物利用率顯著增加,特別是具有重要生物活性功能的多酚類物質白藜蘆醇含量迅速增加[2]。

白藜蘆醇最初是由日本學者Takaoka 于1940年在毛葉藜蘆中所發現的,從此為世人所知[3]。1963年,在我國中藥材虎杖中首次發現了白藜蘆醇[4]。白藜蘆醇是一種多酚類物質,易溶于乙酸乙酯、乙醇、丙酮等有機溶劑,難溶于水[5],具有抗氧化、清除自由基、消除炎癥、調控血糖、抗衰老、抗癌、抗腫瘤、保護心腦血管等作用[6-13]。近年來,白藜蘆醇已逐漸被人們接受,其應用已擴展到食品、保健品、化妝品等領域[14]。白藜蘆醇提取方法眾多,常用的有酶水解法、乙醇提取法、超聲提取法、微波提取法、堿提酸沉法等,但超聲-微波協同提取白藜蘆醇的研究報道較少。本研究采用超聲-微波協同提取花生芽白藜蘆醇,通過PB試驗設計和響應面試驗優化白藜蘆醇提取工藝,同時對其進行體外抗氧化活性評價,以期為花生芽的綜合開發提供新的思路,增加花生產業的附加值,為白藜蘆醇的工業化生產提供新的來源和技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗原料與儀器

試驗室自制培養花生芽;阿卡波糖、反式白藜蘆醇分析對照品(純度≥98.0%,北京索萊寶科技有限公司);無水乙醇、乙酸乙酯、甲醇、石油醚(30～60℃)、DPPH、VC、30%雙氧水、硫酸亞鐵、水楊酸、濃鹽酸、碳酸鈉(分析純,國藥集團化學試劑公司);α-葡萄糖苷酶(50 U/mg)、對硝基苯基-α-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG)(上海源葉生物科技有限公司)。

FA1204型電子天平(寧波市鄞州華豐電子儀器廠);RE-52AA 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);UV2000紫外分光光度計(尤尼柯儀器公司);超聲波微波萃取儀(寧波新芝生物有限公司);雙列四孔電熱恒溫水浴鍋(上海樹立儀器有限公司);高速多功能粉碎機(永康市鉑歐五金制品有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1 白藜蘆醇標準曲線的制作

參照周煥霞等的標準曲線制作方法并略作修改[15-19]。以吸光度對白藜蘆醇濃度做標準曲線。

1.2.2 培養天數對花生芽白藜蘆醇含量的影響

選取顆粒飽滿、無霉變的花生種子,將其浸泡于25～30℃溫水中8～12 h,待充分吸水膨脹后移至恒溫恒濕培養箱(溫度26℃、濕度60%左右),避光催芽,每天淋水2～3次,待芽長至約5 cm 時,移至育苗盆繼續培養,根據發芽時間每天取樣100 g,凍干磨粉備用。

1.2.3 不同提取方法對白藜蘆醇提取含量的影響

溶劑提取法:參照汪海峰等[20]。堿提酸沉法:參照尚天翠等[21]。超聲提取法:參照初麗君等[22]。微波提取法:參照繆文玉等[23]。超聲+微波提取法:參照馬密霞等[24]。

1.2.4 單因素試驗設計

稱量1.0 g花生芽干粉,提取工藝同1.2.3,研究超聲功率、超聲時間、微波功率、微波時間、料液比、乙醇濃度6個因素對白藜蘆醇提取含量的影響。

1.2.5 Plackett-Burman試驗設計

利用Plackett-Burman 試驗設計篩選出對響應值影響較大的因素[25]。在單因素試驗的基礎上,篩選乙醇濃度、料液比、超聲時間、超聲功率、微波時間、微波功率6個因素對白藜蘆醇提取含量的影響,每個因素設為高(1)、低(-1)兩個水平,試驗因素及水平見表1。

表1 Plackett-Burman 試驗設計因素及水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman test design

1.2.6 響應面試驗設計

根據Plackett-Burman 試驗的篩選結果,選擇對白藜蘆醇提取影響具顯著性的因素,根據Box-Benhnken中心組合試驗設計原理,對花生芽白藜蘆醇的超聲-微波協同提取工藝進行優化,以獲得最佳提取工藝。

1.2.7 白藜蘆醇抗氧化活性測定

①白藜蘆醇對DPPH自由基清除能力的影響。參照喬曉月等的方法并略作修改[26]。

式中:A1-樣品、DPPH;A2-樣品、無水乙醇;A0-DPPH、無水乙醇。

②白藜蘆醇對ABTS自由基清除能力的影響。參照張寬朝等的方法并略作修改[27]。

式中:Ai-樣品、ABTS;Aj-樣品、無水乙醇;A0-無水乙醇、ABTS。

③白藜蘆醇對α-葡萄糖苷酶活力的影響。參照趙姝婷等的方法并略作修改[28]。

固定酶濃度0.2 U/mL,PNPG為5.0 mmoL/L,用0.1 moL/L(p H6.8)磷酸鹽緩沖液溶解。96孔板中加入60μL不同濃度樣品溶液,同時加入50μL PNPG,37℃恒溫震蕩15 min,取出后加入50μL α-葡萄糖苷酶,37℃恒溫震蕩20 min,最后加入50μL 0.2 mo L/L碳酸鈉溶液終止反應,酶標儀測定405 nm 波長吸光度。

式中:A1-樣品、α-葡萄糖苷酶、PNPG、碳酸鈉;A2-樣品、磷酸緩沖液、PNPG、碳酸鈉;A3-磷酸緩沖液、α-葡萄糖苷酶、PNPG、碳酸鈉;A4-磷酸緩沖液、PNPG、碳酸鈉。

1.3 數據處理

采用Excel 2019 對單因素試驗數據進行處理,使用SPSS對單因素進行P＜0.05水平顯著性分析。運用Design-Expert 12.0中的Plackett-Burman試驗設計和Box-Behnken 中心試驗設計,試驗結果進行分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 花生發芽天數對白藜蘆醇含量的影響

由圖1可知,隨著花生發芽天數的增加,白藜蘆醇的含量逐漸升高,當培養天數為13 d時,白藜蘆醇含量達到最高值,再增加培養天數白藜蘆醇含量略微降低,且消耗時間較長,因此選擇培養13 d的花生芽作為提取原料。

圖1 不同培養天數對花生芽中白藜蘆醇含量的影響Fig.1 Effect of different culture days on resveratrol content in peanut sprouts

2.2 不同提取方法對白藜蘆醇提取含量的影響

不同提取方法對白藜蘆醇的提取效率會產生不同的影響,我們對提取產物中白藜蘆醇的含量進行了分析,結果如表2所示。表2可看出,堿提酸沉提取法的白藜蘆醇含量最低為2.27 mg/g,超聲-微波協同提取的效率最高,白藜蘆醇提取含量高達8.00 mg/g,顯著高于微波提取法、堿提酸沉提取法和溶劑提取法(P＜0.05),故選擇超聲-微波協同提取法進行試驗。

表2 提取方式對白藜蘆醇提取含量的影響Table 2 Effect of extraction method on extraction content of resveratrol

2.3 單因素試驗

2.3.1 超聲功率和超聲時間對白藜蘆醇提取含量的影響

由圖2(A)可知,白藜蘆醇提取含量隨超聲功率呈先增大后減少的趨勢,在290 W 時提取含量最高為7.80 mg/g,并顯著高于其他功率時的提取含量,故最佳超聲功率為290 W。由圖2(B)可知,隨著超聲時間延長,白藜蘆醇提取含量顯著增加,在3 min時提取含量達7.89 mg/g,繼續延長時間,呈顯著減少趨勢,因此,綜合提取含量和時間成本的考慮,提取時間選擇3 min為宜。

圖2 超聲功率和超聲時間對白藜蘆醇提取含量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power and ultrasonic time on the extraction content of resveratrol

2.3.2 微波功率和微波時間對白藜蘆醇提取含量的影響

由圖3(A)可知,隨微波功率的增加,白藜蘆醇提取含量逐漸增加,當微波功率為380 W 時,白藜蘆醇提取含量達到最高值7.91 mg/g,繼續增加功率,呈顯著減少趨勢,因此,微波功率選擇380 W 為宜。由圖3(B)可知,白藜蘆醇提取含量在微波作用90～120 s時隨微波時間的增加而增加,到120 s時提取含量達到最大,所以最適微波提取時間為120 s。繼續延長時間,呈逐漸減少趨勢,因此,選擇微波提取120 s為最佳。

圖3 微波功率和微波時間對白藜蘆醇提取含量的影響Fig.3 Effect of microwave power and microwave time on resveratrol extraction content

2.3.3 料液比和乙醇濃度對白藜蘆醇提取含量的影響

由圖4(A)可知,隨料液比的增加,提取含量逐漸提高。當料液比繼續增大到一定程度后,由于花生芽粉中的白藜蘆醇含量有限,所以提取率反而略有降低。因此選擇最佳料液比為1∶30。由圖4(B)可知,隨著乙醇濃度的增加,白藜蘆醇的提取含量逐漸增加,當乙醇濃度為65%時,白藜蘆醇提取含量達到最高,之后繼續增大乙醇濃度白藜蘆醇含量逐漸降低,因此選擇65%乙醇溶液較為合適。

圖4 料液比和乙醇濃度對白藜蘆醇提取含量的影響Fig.4 Effect of solid to liquid ratio and ethanol concentration on resveratrol extract content

2.4 Plackett-Burman試驗設計結果與分析

通過Plackett-Burman試驗設計對影響白藜蘆醇提取的因素進行顯著性分析,試驗設計及結果見表3,各因素效應顯著性評價結果見表4。另外,由表征影響因素次序的Pareto圖可知,影響因素的顯著性由大到小依次為料液比(B)＞乙醇濃度(A)＞微波功率(F)＞超聲功率(D)＞微波時間(E)＞超聲時間(C),其中料液比對白藜蘆醇得率的影響達到了顯著水平(P＜0.05),按照各因素的影響大小順序,選擇料液比(B)、乙醇濃度(A)、微波功率(F)三個因素進行響應面優化設計。在優化提取的過程中,將超聲功率、微波時間和超聲時間這三個因素分別固定為290 W、120 s和3 min(圖5)。

圖5 影響因素標準化的Pareto圖Fig.5 Pareto chart of influencing factor standardization

表3 Plackett-Burman試驗方案和結果Table 3 Experimental design and result of Plackett-Burman design

表4 Plackett-Burman 試驗設計各因素效應評價Table 4 Effect evaluation of each factor under Plackett-Burman test design

2.5 響應面試驗設計結果及分析

在Plackett-Burman 試驗設計結果分析的基礎上對乙醇濃度、料液比、微波功率3個因素設計響應面分析試驗(表5),分析結果見表6,對表6中的數據進行回歸分析處理,結果見表7。由表7可以看出,乙醇濃度對提取含量有顯著影響(P＜0.05),微波功率對提取含量有極顯著影響(P＜0.01)。乙醇濃度與料液比之間存在極顯著的交互作用(P＜0.01),乙醇濃度與微波功率之間交互作用不顯著。

表5 試驗設計因素和水平表Table 5 Experimental factors level

表6 響應面試驗設計及結果Table 6 Response surface test design and results

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis for regression model

經逐步回歸分析,取得最佳二次回歸方程(P＜0.05),由=0.8659、PredR2=0.8179、Adeq Precision(信噪比)值遠大于4可見,回歸方程擬合度和可信度均很高,能夠較好地反應三個變量之間的關系。白藜蘆醇提取量=-3.59150+2.72070A+1.91740×B-0.56435×F-0.026100×AB+0.001775×AF-0.0006750×BF-0.0203900×A2+0.0006100×B2+0.000638125×F2。

2.5.1 響應面交互作用分析

響應面3D 曲面圖反映兩兩因素之間對響應值的影響作用,其中3D曲面圖越陡峭,說明兩因素之間交互作用越明顯[29]。圖6可看出,乙醇濃度和料液比之間交互作用顯著(P＜0.05),乙醇濃度和微波功率、料液比和微波功率之間交互作用不顯著(P＞0.05)。該結果與方差分析結果一致。

圖6 交互作用對白藜蘆醇含量影響的響應面圖Fig.6 Response surface diagram of the effect of interaction terms on the content of resveratrol

2.5.2 最優提取工藝參數及驗證

通過Design-Expert 8.0設計分析得到超聲-微波協同提取白藜蘆醇最佳工藝:乙醇濃度60.75%、料液比1∶34.58,微波功率399.64 W、預測白藜蘆醇含量為8.84 mg/g。結合實際操作,修訂為乙醇濃度60%、料液比1∶35、微波功率400 W。此時白藜蘆醇提取含量為8.64 mg/g,RSD 為0.2%,說明模型有效。

2.6 抗氧化活性的測定

2.6.1 DPPH 自由基清除能力的測定

如圖7所示,花生芽白藜蘆醇對DPPH 自由基的清除率隨質量濃度的增加而增大,質量濃度在15～30μg/mL 范圍內,花生芽白藜蘆醇對DPPH 自由基清除率顯著低于VC。當質量濃度在30～240μg/m L時,白藜蘆醇對DPPH 自由基的清除率趨近于VC,且質量濃度為240μg/m L時,花生芽白藜蘆醇對DPPH 自由基的清除率達92.80%,VC對DPPH 自由基的清除率達94.80%,表明花生芽白藜蘆醇具有良好的抗氧化活性。

圖7 花生芽白藜蘆醇對DPPH 自由基清除率曲線Fig.7 DPPH radical scavenge rate by resveratrol from peanut sprouts

2.6.2 ABTS自由基清除能力的測定

如圖8所示,在試驗條件下,花生芽白藜蘆醇粗提液對ABTS自由基有明顯的清除能力,且隨著質量濃度的增加,清除率也逐漸上升,在濃度為260μg/m L時,花生芽白藜蘆醇對ABTS自由基的清除率達97.84%,VC對ABTS自由基的清除率達93.76%,花生芽白藜蘆醇對ABTS自由基的清除率遠高于相同濃度下VC對ABTS的清除率,說明花生芽白藜蘆醇對ABTS自由基的清除效果強于VC。

圖8 花生芽白藜蘆醇對ABTS自由基清除率曲線Fig.8 ABTS radical scavenge rate by resveratrol from peanut sprouts

2.6.3 花生芽白藜蘆醇對α-葡萄糖苷酶活性抑制率的測定

由圖9可看出,花生芽白藜蘆醇和阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶都有較好的抑制作用,均隨著質量濃度的增加而增大,但在相同濃度下阿卡波糖抑制效果強于花生芽白藜蘆醇,在質量濃度為620μg/m L時,阿卡波糖抑制率為96.29%,花生芽白藜蘆醇抑制率為90.73%,花生芽白藜蘆醇抑制率略低于阿卡波糖,由此證明阿卡波糖和花生芽白藜蘆醇都能抑制α-葡萄糖苷酶的活性,從而使α-葡萄糖苷酶對PNPG的水解能力降低。研究結果為白藜蘆醇產品的研發提供了一定的理論參考。

圖9 花生芽白藜蘆醇對α-葡萄糖苷酶活性的抑制率Fig.9 The inhibition rate of resveratrol from peanut sprouts on α-glucosidase activity

3 結論

試驗采用花生培養13 d時的花生芽作為提取白藜蘆醇原料,通過單因素、PB 試驗設計和響應面中心組合試驗得出,花生芽白藜蘆醇的最佳提取工藝為:乙醇體積分數60%,料液比1∶35(g/m L),超聲功率290 W,超聲時間3 min,微波功率400 W,微波時間120 s,在此條件下花生芽白藜蘆醇提取含量為8.64 mg/g。

通過體外抗氧化活性評價表明,花生芽白藜蘆醇在清除DPPH 自由基和ABTS自由基能力方面具有較好的能力,且對ABTS的清除能力強于VC;花生芽白藜蘆醇在抑制α-葡萄糖苷酶活力方面也具有較強的能力。綜上所述,花生芽白藜蘆醇是一種天然的抗氧化物,具有極大的應用價值和潛力,有必要對其做進一步研究。