雙氫青蒿素與火把花根配伍對佐劑性關節炎模型大鼠的保護作用

何沛霖， 涂如霞， 梅小利， 張 莉， 黃崇剛， 占敏霞， 陳 慧

(重慶市中藥研究院藥理毒理研究所，重慶 400065)

青蒿素及其衍生物是目前抗瘧藥物中作用最快和療效最高的一線抗瘧藥物[1-2]。雖然目前對青蒿素藥理作用的研究有了重要進展，但其確切的機制仍有待闡明[3-6]。青蒿素除了具有抗寄生蟲的作用外，還具有抗炎、抗氧化、抗病毒等藥理作用。雙氫青蒿素是水溶性好、吸收快、毒性較小及抗瘧作用明顯的具有良好開發前景的藥物[7-9]?；鸢鸦ǜ怯衫ッ魃胶Ｌ娜テず透竞蠖兄瞥傻闹谐伤?，具有抗炎、鎮痛及抑制病理性免疫反應作用，已被廣泛用于自身免疫性疾病的治療[10-12]。

類風濕性關節炎是一種病因不明以炎性滑膜炎為主的慢性全身性疾病，以慢性、對稱性、多滑膜關節炎和關節外病變為主要臨床表現[13]，但其具體機制仍不明確。前期研究顯示雙氫青蒿素與火把花根配伍的免疫抑制作用強于單獨用藥，且毒性更低，但其作用機制尚不明確[14-15]，本文擬研究雙氫青蒿素與火把花根配伍對佐劑性關節炎模型大鼠的保護作用及其可能的作用機制，以期為兩者聯合用藥在臨床治療中的應用提供理論和實驗依據。

1 材料

1.1 藥物 雙氫青蒿素(片)，昆藥集團重慶武陵山制藥有限公司，批號C00120181113，含量100.4%，配制時滴加2～3滴吐溫-80碾磨后再用0.5% CMC-Na混勻稀釋至實驗所需質量濃度；火把花根浸膏，重慶市中藥研究院中藥化學研究所，批號GST190501，每1 g浸膏含生藥量15.67 g，使用時加入0.5% CMC-Na碾磨混勻至實驗所需質量濃度。

1.2 動物 SPF級雄性SD大鼠，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，實驗動物生產許可證號SCXK(遼)2015-0001，動物質量合格證號211002300046310、211002300048140。檢疫及適應性飼養合格后用于實驗，大鼠飼養環境為溫度(22±2)℃，相對濕度50%～70%，自由飲食和飲水，所有實驗動物的使用和喂養均嚴格遵照動物保護協會所規定的有關條款，該動物實驗經重慶市中藥研究院實驗動物福利倫理審查委員會審查通過。

1.3 試劑 弗氏完全佐劑(FCA)、戊巴比妥鈉，美國Sigma公司，批號SLBK7817V、P1302716；TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、VEGF試劑盒，深圳欣博盛生物科技有限公司，批號R190929-102a、R190929-101a、R190929-007a、R190929-003a、R190929-103a；MMP-1試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號3W33F4DAXU；VEGFA、MMP-1、MIF抗體，英國Abcam公司，批號GR3200812-2、GR242901-33、GR270048-26；兔SP試劑盒、DAB顯色試劑盒，北京中杉金橋生物技術有限公司，批號K216713D、K217721A；RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒，日本TaKaRa公司，批號AI12244A、AJ12464A、AHF1910A。

1.4 儀器 R2000-3型電子計重計數天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；BS224S型電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；PV-200型足跖容積測量儀，成都泰盟科技有限公司；ST-360型酶標儀，上?？迫A試驗系統有限公司；電泳儀，美國Bio-Rad公司；Tanon-5200型凝膠成像系統，上海天能科技有限公司；圖像分析系統，美國Labworks公司；實時熒光定量PCR儀，美國ABI 公司；高級智能脫水機、石蠟包埋機、輪轉切片機，德國徠卡公司；光學顯微鏡，日本奧林巴斯公司；Mias-2000型病理圖像處理系統，四川大學圖像圖形研究所。

2 方法

2.1 模型建立及給藥 取10只雄性SD大鼠設為正常組，不作處理；其余大鼠于右后足跖皮內注射FCA 0.1 mL/只[16-17]，注射后第14天，將造模成功的大鼠隨機分為4組，即模型組、雙氫青蒿素+火把花根配伍組(0.05 g/kg+3.75 g/kg)、雙氫青蒿素(0.1 g/kg)組、火把花根(7.5 g/kg)組，每組10只。給藥組分別灌胃給予相應藥物，正常組和模型組灌胃給予等體積0.5% CMC-Na溶液，容量1 mL/100 g，每天1次，連續給藥21 d。

2.2 關節腫脹度檢測

2.2.1 測量足跖容積 造模前、給藥前和給藥第7、14、21天分別測量大鼠左后足(繼發病變側)及右后足的容積1 次，測量范圍為踝關節及以下，計算關節腫脹率。

2.2.2 關節指數 給藥前和給藥第7、14、21天根據大鼠前后肢踝關節、趾關節紅腫程度及受影響關節指數進行評分。0分，正常，無紅腫；1分，1個關節紅腫；2分，2個及2個以上關節紅腫；3分，踝關節以下足掌嚴重紅腫；4分，包括踝關節在內的全部足爪紅腫且不能負重。四肢分別進行評分，累計總和即為關節指數。

2.3 ELISA法檢測炎癥細胞因子水平 末次給藥后1 h，大鼠麻醉后腹主動脈采血，離心得血清，用酶聯免疫吸附法檢測TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、VEGF、MMP-1水平。

2.4 HE染色觀察關節滑膜組織病理學改變 將大鼠的右足跖關節固定在10%甲醛中16 h以上，10% EDTA脫鈣，脫水，浸蠟，包埋，切片，HE染色。鏡下觀察關節滑膜增生及炎癥程度，并進行半定量評分，評分標準見表1。

表1 組織半定量評分標準

2.5 Western blot檢測足跖關節滑膜組織VEGF、MMP-1及MIF蛋白表達 收集各組大鼠右足跖關節滑膜組織，提取蛋白，BCA檢測總蛋白濃度，SDS-PAGE電泳，轉膜，封閉，一抗(VEGF及MMP-1，1∶1 000)4 ℃孵育過夜，二抗(1∶1 000)室溫孵育2 h，TBST清洗，曝光顯影，采用Tanon-5200成像系統檢測條帶灰度值，計算目的蛋白與內參蛋白的灰度比值。

2.6 RT-qPCR檢測VEGF、MMP-1、MIFmRNA表達 提取各組大鼠右足跖關節滑膜組織RNA，并逆轉錄為cDNA。按照SYBR Green熒光染料法進行定量PCR檢測，引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，引物序列見表2。PCR反應條件為95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40個循環。采用2-△△CT法進行半定量分析。

表2 引物序列

3 結果

3.1 雙氫青蒿素-火把花根配伍對佐劑性關節炎模型大鼠足跖容積的影響 與正常組比較，模型組大鼠左后足、右后足關節腫脹率均升高(P<0.01)，說明造模成功；與模型組比較，給藥第14、21天，配伍組大鼠左后足、右后足關節腫脹率降低(P<0.05)，提示雙氫青蒿素與火把花根配伍對弗氏完全佐劑所致的關節炎模型有明顯抑制作用，見表3～4。

表3 雙氫青蒿素-火把花根配伍對佐劑性關節炎模型大鼠左后足關節腫脹率的影響

表4 雙氫青蒿素-火把花根配伍對佐劑性關節炎模型大鼠右后足關節腫脹率的影響

3.2 雙氫青蒿素-火把花根配伍對佐劑性關節炎模型大鼠關節指數的影響 與正常組比較，模型組大鼠關節指數升高(P<0.01)；與模型組比較，給藥第21天，配伍組大鼠關節指數降低(P<0.05)，見表5。

表5 雙氫青蒿素-火把花根配伍對佐劑性關節炎模型大鼠關節指數的影響

3.3 雙氫青蒿素-火把花根配伍對佐劑性關節炎模型大鼠血清中炎癥細胞因子水平的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清中炎癥細胞因子水平升高(P<0.01)；與模型組比較，配伍組大鼠血清IFN-γ、VEGF及MMP-1水平降低(P<0.05，P<0.01)，雙氫青蒿素組和火把花根組VEGF及MMP-1水平降低(P<0.05，P<0.01)，見表6。

3.4 雙氫青蒿素-火把花根配伍對佐劑性關節炎模型大鼠關節滑膜組織病理改變的影響 如圖1所示，模型組大鼠關節囊結締組織壞死、水腫伴炎細胞浸潤和纖維組織增生；與模型組比較，配伍組大鼠踝關節囊結締組織壞死、炎細胞浸潤程度明顯減輕，纖維組織增生降低。組織半定量評分結果如表7所示，與模型組比較，配伍組大鼠組織評分結果降低(P<0.05)。提示，雙氫青蒿素-火把花根配伍對模型大鼠造模處軟組織損傷有明顯改善和修復作用。

表6 雙氫青蒿素-火把花根配伍對佐劑性關節炎模型大鼠炎癥細胞因子的影響

表7 雙氫青蒿素-火把花根配伍對佐劑性關節炎模型大鼠組織半定量評分的影響

3.5 雙氫青蒿素-火把花根配伍對佐劑性關節炎模型大鼠關節滑膜組織VEGFA、MMP-1及MIF蛋白表達的影響 如圖2所示，與正常組比較，模型組大鼠關節滑膜組織VEGFA、MMP-1及MIF蛋白表達升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組VEGFA、MMP-1及MIF蛋白表達降低(P<0.01)。

3.6 雙氫青蒿素-火把花根配伍對佐劑性關節炎模型大鼠關節滑膜組織VEGF、MMP-1及MIFmRNA表達的影響 如圖3所示，與正常組比較，模型組大鼠關節滑膜組織VEGF、MMP-1及MIFmRNA表達升高(P<0.01)；與模型組比較，各給藥組大鼠關節滑膜組織VEGF、MMP-1及MIFmRNA表達降低(P<0.01)，見圖3。

4 討論

類風濕性關節炎是一種以炎癥細胞浸潤和滑膜組織增生、肥厚以及骨損傷為特征的慢性全身性自身免疫疾病。佐劑性關節炎模型是一種與人類風濕性關節炎病理極為相似的一種免疫炎癥模型，作為研究人類風濕關節炎常用的實驗模型。本研究顯示，模型組大鼠足關節腫脹率、關節指數升高，造模處踝關節有明顯的病理變化，且血清中炎癥因子水平升高，表明佐劑性關節炎模型制備成功；雙氫青蒿素-火把花根配伍降低佐劑性關節炎模型大鼠關節腫脹率、關節指數，明顯改善和修復造模處軟組織損傷，且配伍組修復效應強于單獨用藥組，提示配伍用藥具有增效的作用。

在類風濕性關節炎的發病過程中，促炎性與抑炎性細胞因子失去平衡會導致滑膜炎癥。IFN-γ通過活化巨噬細胞從而介導局部炎癥的免疫應答，在炎癥反應中起到重要調節作用[18]。TNF-α通過誘導內皮細胞表達黏附分子，以促進血管內皮和白細胞黏附滲透，導致局部炎癥引起組織損傷，并同時促進成纖維細胞和滑膜巨噬細胞增殖，從而直接導致軟骨和骨損傷[19]。IL-1β與機體炎癥程度呈正相關，能誘導IL-6的產生，IL-6參與機體的免疫反應，誘導抗體的合成，從而引起免疫功能紊亂[20-21]。本研究結果顯示，佐劑性關節炎模型大鼠炎癥因子水平升高，經配伍組治療，大鼠血清炎癥因子水平降低，表明雙氫青蒿素-火把花根配伍能抑制佐劑性關節炎模型的炎癥反應。

血管生成在類風濕性關節炎的發病過程中會加劇軟骨和骨的破壞，VEGF是促進類風濕性關節炎新血管生成和分化的主要因子[22]。MMPs是細胞外基質(ECM)成分降解過程中必不可少的酶，可促進血管新生[23]。MIF通過活化巨噬細胞并抑制其移動，增強巨噬細胞在炎癥局部的聚集和浸潤，從而極大地促進炎癥和免疫反應[24]。本研究結果顯示，雙氫青蒿素-火把花根配伍抑制大鼠關節滑膜組織VEGF、MMP-1及MIF表達，降低血清中炎癥因子水平，提示雙氫青蒿素-火把花根配伍改善大鼠類風濕性關節炎炎癥反應與抑制VEGF、MMP-1及MIF表達有關。

綜上所述，雙氫青蒿素-火把花根配伍對大鼠佐劑性關節炎具有治療作用，其機制可能是通過抑制VEGF、MMP-1及MIF的表達，調節相關炎癥因子產生和分泌，進而抑制炎癥細胞的浸潤、滑膜組織的增生及新血管的生成，減輕軟骨和骨破壞，從而發揮治療類風濕性關節炎的作用，本研究將為雙氫青蒿素-火把花根治療類風濕性關節炎提供實驗基礎，為臨床應用中兩者聯合用藥提供理論依據，具有潛在的應用前景。