團頭魴SOCS家族基因的分子特征及其對嗜水氣單胞菌脅迫的響應

翟文婭，李博，王濟秀，王煥嶺，劉紅

華中農業大學水產學院/農業農村部淡水生物繁育重點實驗室/長江經濟帶大宗水生生物產業綠色發展教育部工程研究中心，武漢 430070

細胞因子信號轉導抑制因子（suppressor of cyto?kine signaling，SOCS）家族成員是重要的細胞因子受體信號反饋抑制因子[1］，可以通過對細胞因子誘導的信號通路進行負調控從而防止過多的信號干擾免疫系統發育及其功能調控[2］。細胞因子誘導的含SH2結構域蛋白（cytokine-inducible SRC homology 2 do?main protein，CISH）在1995 年被發現，它是SOCS 家族中第一個被發現的成員[3］；隨后在1997 年，人們發現了SOCS1[4］；至今，人們在哺乳動物中共發現了8個SOCS 家族成員，分別為SOCS1~SOCS7 與CISH[5］；在魚類中，還發現了SOCS3b、SOCS5b、SOCS8以及SOCS9[6-7］等魚類特有的成員。

目前，在哺乳動物中對SOCS 家族基因功能已有深入研究，已有大量研究探究了SOCS 家族基因的主要功能[8-10］。但是在魚類中，有關SOCS 家族基因的研究有限，目前僅在半滑舌鰨（Cynoglossus semi?laevis）[11］、牙鲆（Paralichthys olivaceus）[12］、斑點叉尾鮰（Ictalurus punctatus）[13］等部分水產動物中驗證了其在免疫應答方面發揮著至關重要的作用。

團頭魴（Megalobrama amblycephala）屬鯉形目（Cypriniformes）、鯉科（Cyprinidae）、鲌亞科（Culteri?nae）、魴屬（Megalobrama），因其具有肉質較嫩、個體規格適于中國家庭消費、生長速度較快、易于養殖且養殖成本不高等優點而備受廣大養殖戶的青睞。但是近年來，不合理的養殖結構和布局及濫用藥物等，嚴重阻礙了其養殖業的持續健康發展。其中由嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）引發的細菌性敗血癥每年都會導致大量的團頭魴死亡，造成巨大經濟損失。團頭魴抗嗜水氣單胞菌感染的相關基因的研究已有很多[14-16］，本研究一方面通過對團頭魴SOCS 家族基因進行生物信息學分析來確定其分子特征；另一方面探究SOCS 家族基因在健康團頭魴各組織與嗜水氣單胞菌感染后的表達模式，旨在為進一步探究團頭魴SOCS 家族在抵抗嗜水氣單胞菌感染中發揮的免疫功能提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用團頭魴均采集于湖北省洪湖市洪湖水產魚種養殖場，幼魚體質量為（50±10）g，成魚體質量為（500±20）g。將試驗魚轉移到華中農業大學水產學院實驗基地中暫養，水溫為25~28 ℃，24 h 不間斷充氧，早晚各換水1 次，換水量為總體積的1/4，暫養14 d后開始試驗。

1.2 團頭魴SOCS的生物信息學分析

首先檢索NCBI 數據庫（www.ncbi.nlm.nih.gov）獲得團頭魴socs1、socs3a、socs3b基因（GenBank 登錄號：MK101316.1，MH107241.1，MH107242.1）與斑馬魚（Danio rerio）socs2、socs4、socs5a、socs5b、socs6、socs7、socs9基因（登錄號：NM_001114550.1，NM_001111225.1，NM_001113758.2，NM_001113797.1，EF195764.1，NM_001287077.1，NM_001113801.1）的cDNA 序列，并利用斑馬魚socs基因的cDNA 序列通過本地Blast 從團頭魴轉錄組（登錄號：PRJ?NA716731）中獲取對應的團頭魴序列。

通 過ORF Finder（www.ncbi.nlm.nih.gov/orf?finder）預測10個團頭魴socs基因的ORF 及氨基酸序列；利 用ExPASy（http：//web. expasy. org/com?pute_pi/）預測其蛋白質的理論分子質量（MWs）與理論等電點（pI）；使用SMART（http：//smart.embl.de/）預測其蛋白質結構域，并使用IBS 1.0.3 進行繪圖；從GenBank 數據庫獲取斑馬魚、青鳉（Oryzias latipes）、小鼠（Mus musculus）和人（Homo sapiens）等脊椎動物物種已有的SOCS蛋白序列，利用MEGA 6使用鄰接法（Neighbour-Joining，NJ法）構建進化樹。

1.3 試驗樣品采集

為了確定團頭魴socs基因的組織表達模式，分別取3 尾健康團頭魴成魚的心臟、肝臟、脾臟、體腎、頭腎、腦、血液、腸道、肌肉和鰓10個組織（器官）。

為了探究嗜水氣單胞菌感染后團頭魴socs基因的組織表達模式，以團頭魴幼魚為試驗對象，隨機設置對照組與感染組2 個處理組，每一處理設置3 個生物學重復（每個生物學重復取3尾魚）。感染試驗中，對感染組團頭魴每尾腹腔注射0.1 mL 濃度為6.7×106CFU/mL 的嗜水氣單胞菌，對照組腹腔注射等量PBS 緩沖液。在注射后的0、4、12、24、72 h 分別采集感染組和對照組的脾臟、體腎和頭腎組織[17］。

上述樣品快速分離后置于液氮中，凍存24 h 后轉入?80 ℃冰箱中保存備用。

1.4 總RNA的提取及cDNA合成

組織總RNA 提取采用Trizol 法，具體步驟參照Trizol試劑（Invitrogen）說明書。提取的RNA 濃度通過紫外分光光度計（Nanodrop 2000，美國）進行測定，RNA 的完整度與純度通過瓊脂糖凝膠電泳法測定。使用PrimeScript?RT reagent Kit（TaKaRa，日本）試劑盒按照說明書對提取的RNA 進行反轉錄，將獲得的cDNA保存于?20 ℃冰箱。

1.5 半定量PCR及熒光定量PCR（qRT-PCR）

通過半定量PCR 方法檢測socs基因在健康團頭魴不同組織的表達量。PCR 反應體系為10.0 μL，包括cDNA 模板1.0 μL、ddH2O 7.1 μL、10×TaqPCR Buffer 1.0 μL、上下游引物各0.3 μL、dNTP 0.15 μL、TaqDNA 酶0.15 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min后，94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，30個循環，最后72 ℃延伸5 min。擴增后，取5.5 μL PCR產物進行瓊脂糖膠電泳檢測。

通過熒光定量PCR（qRT-PCR）評估團頭魴SOCS家族基因在嗜水氣單胞菌刺激后脾臟、體腎與頭腎中的表達。qRT-PCR反應總體系為20.0 μL，包括SYBR 混合試劑10.0 μL、ddH2O 7.4 μL、cDNA 模板1.0 μL、上下游引物各0.8 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min 后，95 ℃變性10 s、60 ℃退火20 s、72 ℃延伸15 s，進行40個循環。

選擇18S rRNA為內參基因，使用primer pre?mier 5.0 軟件對團頭魴socs設計特異性上下游引物（表1），并由武漢擎科生物科技有限公司合成。

表1 本研究用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.6 數據處理

基因的表達量采用2?ΔΔCt法計算，使用SPSS Statistics 24.0 軟件對數據進行分析，采用Duncan’s進行多重比較，數值均采用“平均值±標準誤”（mean±SE）表示，P<0.05 為統計學差異顯著，P<0.01 為統計學差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 團頭魴10個socs基因序列分析

通過本地Blast 比對NCBI 中獲得的斑馬魚SOCS 家族基因與檢索NCBI 中團頭魴SOCS 家族基 因，共 獲 得socs1、socs2、socs3a、socs3b、socs4、socs5a、socs5b、socs6、socs7、socs9共10 個團頭魴socs基因序列，分別編碼201、197、209、216、378、526、557、530、744、494 個氨基酸，等電點（pI）分布在5.69~9.37，平均等電點為7.85，蛋白分子質量為22.3~80.97 ku，具體信息見表2。

表2 團頭魴SOCS家族基因特征Table 2 Features of SOCS family genes identified in M.amblycephala

預測團頭魴10 個socs基因結構，結果如圖1 所示：團頭魴SOCS 家族基因具有1~8 個外顯子，其中大部分socs基因僅具有1 個外顯子，但socs7具有7 個外顯子。對其蛋白結構域進行預測，結果如圖2 所示，顯示其均含有2 個保守結構域，分別是SOCS BOX 特異性蛋白結構域與SH2 中心結構域。

圖1 團頭魴socs基因結構圖Fig.1 Gene structure of socs in M.amblycephala

圖2 團頭魴SOCS家族蛋白結構域Fig.2 Protein domains of SOCS family in M.amblycephala

2.2 SOCS的系統進化分析

通過MEGA構建SOCS系統進化樹，結果如圖3所示。團頭魴與草魚（Ctenopharyngodon idella）、斑馬魚親緣關系較近，然后與其他硬骨魚類聚為一支，與哺乳動物親緣關系較遠，這與傳統形態學上的物種分類地位一致。進化樹分為2 個主要分支：一支（Ⅰ型）包括SOCS4、SOCS5a、SOCS5b、SOCS6、SOCS7 與SOCS9，另一支（Ⅱ型）包括SOCS1、SOCS2、SOCS3a與SOCS3b。

圖3 脊椎動物SOCS系統進化樹Fig.3 Phylogenetic analysis of SOCS in vertebrates

2.3 SOCS家族基因在健康團頭魴組織中的表達

半定量PCR 結果（圖4）顯示在健康團頭魴成魚中，socs1基因在腦組織中的表達量最高，其次在血液和心臟表達量較高，在腸、體腎、脾臟、頭腎組織中也有不同程度表達，在其余組織的表達量較低或未表達；socs2基因在體腎與血液中的表達量最高，其次為心臟、鰓、肝臟、脾臟與腸；socs3a基因在腦中的表達量最高，其次為血液和脾臟，在肝臟和體腎中也有一定程度的表達；socs3b、socs4、socs5a、socs5b基因在團頭魴各組織中表達量均不高；socs6與socs7在脾臟、體腎、頭腎、腦與血液中表達量均較高；socs9在脾臟中表達量最高，其次為心臟，在除肌肉與鰓以外的組織中也有一定量的表達?？傮w而言，10個團頭魴socs基因在體表組織（鰓、腸）表達量較低，在脾臟、體腎、腦與血液中表達量較高；團頭魴socs1、socs2、socs3a、socs6、socs7與socs9表達量相對其他4個基因較高。

圖4 SOCS家族基因在團頭魴不同組織中的表達Fig.4 Expressions of 10 SOCS family genes in various tissues of M.amblycephala

2.4 嗜水氣單胞菌感染后SOCS家族基因的表達

通過qRT-PCR 結果可知，嗜水氣單胞菌感染后，團頭魴脾臟中sosc5a、sosc5b、sosc6、sosc9表達量無明顯差異，sosc1、sosc3a、sosc3b表達量在嗜水氣單胞菌感染后呈現先上升后下降的趨勢，且均在12 h達到峰值；sosc2、sosc7表達量在嗜水氣單胞菌感染后4 h 均出現顯著下調，sosc2表達量在12 h 出現短暫回升并于感染后24 h 再次顯著下調，sosc7表達量則是在24 h 出現上調表達后于72 h 恢復至初始水平；sosc4表達量在嗜水氣單胞菌感染后先顯著下調后逐漸回升至初始水平（圖5A）。

嗜水氣單胞菌感染后，團頭魴體腎中sosc4、sosc5b、sosc9表達量無明顯差異，sosc1、sosc3a、sosc3b表達量變化趨勢與脾臟中一致，其中sosc1與sosc3a在感染后12 h達到峰值，sosc3b在感染后24 h達到峰值；sosc6、sosc7表達量呈現先上升后下降的趨勢；sosc2在4 h表達顯著上調，在12 h出現短暫回落并于感染后24 h 再次顯著上調，在72 h 恢復至初始水平；sosc5a表達量在在嗜水氣單胞菌感染后出現下調，24 h出現短暫輕微上調后再次下調（圖5B）。

嗜水氣單胞菌感染后，團頭魴頭腎中sosc2、sosc5a表達量無明顯差異，sosc1、sosc3a、sosc3b、sosc6表達量仍呈現先上升后下降的趨勢，均在感染后12 h時達到峰值；sosc4、sosc5b、sosc9、sosc7表達量在嗜水氣單胞菌感染后出現下調現象，其中sosc4在感染后24 h出現短暫回升但未恢復至初始水平，72 h再次出現下調趨勢；sosc7在短暫下調后24 h 出現回升，72 h后恢復至初始水平（圖5C）。

圖5 嗜水氣單胞菌感染后SOCS家族基因在團頭魴脾臟（A）、體腎（B）和頭腎（C）中的表達量Fig.5 Relative expression of SOCS family gene in spleen（A），kidney（B）and head kidney（C）of M.amblycephala after infection by Aeromonas hydrophila

3 討 論

細胞因子具有多效性，它在免疫調節、細胞增殖以及受損組織修復等多個過程中發揮著重要作用[18］。SOCS 蛋白可通過多種機制減弱細胞因子信號轉導，對細胞因子發揮負調控作用[13］。已有研究發現，SH2 中心結構域可與N 區協同，通過結合特定細胞因子受體識別目標蛋白，從而調節細胞因子信號轉導[19］，SOCS BOX 特異性蛋白結構域可以結合泛素蛋白對其降解。因此，在信號傳遞過程中，SOCS 蛋白主要是由SH2 中心結構域特異性識別目標蛋白后通過SOCS BOX 特異性蛋白結構域使其降解。此外，在草魚、梭魚（Liza haematocheila）等魚類中，SOCS 家族基因蛋白具有高度保守的SH2 中心結構域和SOCS BOX 特異性蛋白結構域[20-21］，本研究中的團頭魴SOCS 蛋白均含有這2 個特征蛋白結構域，此結果與已有研究相同，表明這10 個SOCS 蛋白結構相對保守。

系統進化分析表明，10 個SOCS 可分為2 個亞族：Ⅰ型家族中包括SOCS4、SOCS5a、SOCS5b、SOCS6、SOCS7 與SOCS9，Ⅱ型家族包括SOCS1、SOCS2、SOCS3a 與SOCS3b，這與梭魚等物種中已有研究結果一致[21-22］。在果蠅中只存在Ⅰ型亞族的類似基因[23］，因此可推測在進化過程中，Ⅱ型亞族成員可能是由Ⅰ型亞族成員基因復制產生，硬骨魚類中特有的幾種socs基因也表明類似的基因復制也發生在魚類進化的過程中[18］。

健康團頭魴半定量PCR 結果顯示，socs1和socs9在心臟中表達量較高；socs3a、socs6與socs3b在肝臟中表達量較高，細胞因子在葡萄糖代謝、脂肪代謝以及蛋白質代謝過程中均有參與，那么SOCS 作為細胞因子信號抑制蛋白的1種，在團頭魴重要代謝器官肝臟中具有高表達可能與此有一定關系。脾臟與體腎是魚體重要的免疫器官[24］，在本研究中，socs1、socs3a與socs9在脾臟中表達量較高，socs1與socs2在體腎中表達量較高，這表明其可能在免疫應答中發揮著重要作用。在腦中，socs1和socs3a高表達，暗示其可能在血腦屏障的建立中起著一定作用[21］；socs2具有調節神經祖細胞分化的功能，同時也可以影響神經元與中間神經元間的信息傳遞[25］，符合其在腦中有一定表達量的研究結果；socs7基因缺失小鼠相較于野生型小鼠體質量輕，同時約有50%的小鼠在出生后2 周頭蓋骨會出現畸形，大腦皮層變薄并最終死亡[10］，這意味著它在大腦發育過程中發揮著不可或缺的作用，與其在腦中高表達結果相一致。

在魚類中，Poly（I：C）、LPS 和細菌已被證明能夠影響socs基因的表達[26-27］。本研究中，團頭魴在嗜水氣單胞菌感染后的4 h 內，部分socs基因出現差異表達現象，表明在急性反應期間SOCS 家族基因會發揮一定作用。在嗜水氣單胞菌感染后，socs2在頭腎中無顯著性變化，在脾臟中顯著下調，而在體腎中顯著上調，推測這與socs2在不同組織中發揮作用不同有關；socs1、socs3a與socs3b在團頭魴頭腎、脾臟、體腎中的總體變化趨勢相同，均為顯著上調。據報道，溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）感染卵形鯧鲹（Trachinotus ovatus）后在3 個免疫組織（頭腎、肝臟、脾臟）中socs1、socs3的表達量均顯著升高[13］；愛德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）感染3 h 后，斑點叉尾鮰腸道中socs1表達量顯著上調；遲緩愛德華菌（Ed?wardsiella tarda）感染后，半滑舌鰨肝臟、體腎與脾臟中socs1表達量在所檢測時間點均出現顯著上調[11］，這些研究結果與本試驗研究結果均表明socs1、socs3a與socs3b在細菌感染后機體免疫過程中發揮了重要功能。socs4在感染后表達量小幅度降低但仍有統計學差異，這意味著其可能以低表達量協同參與調控過程。socs5a、socs5b表達量在感染前后幾乎無顯著差異，這暗示了它們可能不參與機體免疫防御過程。socs6在頭腎中表達量出現了顯著上調，socs7在3 個組織中同樣出現了顯著上調，這意味著其可能在抵抗嗜水氣單胞菌感染過程中也發揮了一定的功能。

綜上所述，本研究初步探究了團頭魴10 個SOCS分子特征，分析了其在健康團頭魴中的組織分布及嗜水氣單胞菌脅迫下的表達模式，可為進一步研究團頭魴SOCS家族基因功能奠定基礎。