HPLC?MS／MS 法同時測定朱日亨滴丸醇提液中7 種成分

李君 董馨?陸景坤祖文白圖雅胡玉霞張夢迪

（1.內蒙古醫科大學新藥安全評價研究中心， 內蒙古 呼和浩特010110； 2.內蒙古醫科大學新藥篩選工程研究中心， 內蒙古 呼和浩特010110； 3.內蒙古醫科大學藥學院， 內蒙古 呼和浩特010110； 4.內蒙古醫科大學基礎醫學院， 內蒙古 呼和浩特010110）

朱日亨滴丸系蒙醫國醫大師蘇榮扎布的臨床驗方，由廣棗、紅花、梔子、沉香、肉豆蔻等9 味藥材組成，方中廣棗性味甘、酸而平，效重、膩，能鎮“赫依”，作為君藥；肉豆蔻性味辛而溫，主鎮司命“赫依”，為臣藥；輔以止痛、清血熱的沉香、梔子等藥材，全方共奏清心火、活血化瘀、改善心功能之功效［1?3］，用于治療冠心病、心絞痛、心律失常等［3?6］。課題組前期對朱日亨滴丸劑型進行了深入研究［7］，但在醇提取工藝考察過程中僅選擇沒食子酸、羥基紅花黃色素A 作為質量控制指標［8］，成分數量偏少，不能全面評價制劑質量，并且采用HPLC 進行含量測定，耗時較長，靈敏度較低。因此，本實驗采用高效液相色譜?質譜串聯（HPLC?MS／MS）法同時測定朱日亨滴丸醇提液中沒食子酸、羥基紅花黃色素A、槲皮素、鞣花酸、西紅花苷Ⅰ、山柰酚、梔子苷的含量，可為該方多組分的定量分析提供依據，也為其醫院制劑申報提供數據支撐。

1 材料

1.1 儀器 LC?MS8045 型三重四極桿UPLC?ESI?MS 聯用系統（配置LC?20AD 型輸液泵、DGU?20A5R 型在線脫氣機、SIL?20AC 型自動進樣器、CTO?20A 型柱溫箱、CBM?20A 型系統控制器、FCV?20AH2 型閥切換系統）、AP135W 型電子天平（十萬分之一）（日本Shimadzu 公司）；KH?500DV型數控超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；DZTW 型電子調溫電熱套（上海力辰邦西儀器科技有限公司）。

1.2 試劑與藥物 廣棗（批號C20022403）、梔子（批號1909010354）、紅花（批號19091202）均購自內蒙古北域藥業有限責任公司，經內蒙古醫科大學藥學院中藥資源教研室渠弼教授鑒定，廣棗為漆樹科植物南酸棗Choerospondias axillaris（Boxb.）Burtt et Hill.的干燥成熟果實，梔子為茜草科植物梔子Gardenia jasminoidesEllis 的干燥成熟果實，紅花為菊科植物紅花Carthamus tinctoriusL.的干燥花。朱日亨滴丸原處方中廣棗、梔子、紅花比例為10∶3∶4（其他藥材比例不納入研究），其傳統劑型為散劑，混合粉碎后過篩、分裝，即可服用。鞣花酸（批號111959?201903，純度≥88.8%）、山柰酚（批號111861?202013，純度≥93.2%）、西紅花苷（批號111588?201704，純度≥88.4%）、羥基紅花黃色素A（批號111637?201810，純度≥93.1%）、槲皮素（批號100081?201810，純度≥99.1%）、沒食子酸（批號110831?201906，純 度≥91.5%）、梔子苷（批號110749?201919，純度≥97.1%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈均為色譜純；甲酸、乙酸銨均為分析純；水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 供試品溶液 按處方比例稱取朱日亨滴丸各味藥材共約68 g，置于圓底燒瓶中，加入40%乙醇408 mL，于磁力加熱攪拌電熱套上加熱提取60 min，冷卻至室溫，濾液用40% 乙醇定容至500 mL量瓶中，取10 μL，加入990 μL 70%甲醇，渦旋混勻30 s，0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.1.2 對照品溶液 精密稱取沒食子酸、羥基紅花黃色素A、槲皮素、鞣花酸、西紅花苷Ⅰ、山柰酚、梔子苷對照品適量，甲醇制成各成分質量濃度分別為436.00、483.00、566.00、547.00、511.00、486.00、458.00 μg／mL 的貯備液，依次精密吸取50.00、300.00、10.00、20.00、100.00、10.00、400.00 μL，甲醇定容至5 mL，即得。再分別吸取5.00、10.00、20.00、40.00、80.00、100.00、200.00、300.00、400.00 μL，70% 甲醇定容至1 mL，得到系列質量濃度，見表1。

表1 對照品溶液質量濃度Tab.1 Concentrations of reference solutions

2.2 分析條件 Shim?pack GIST?HP C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，3 μm）；流動相乙腈（A）?0.1%甲酸（B），梯度洗脫（0～0.5 min，10% A；0.5～3.0 min，10%～45%A；3.0～5.0 min，45%～75%A；5.0～5.5 min，75%～95%A；5.5～7.0 min，95% A；7～7.01 min，95%～10.0% A；7.01～9 min，10.0%A）；體積流量0.25 mL／min；柱溫35 ℃；進樣量3 μL。電噴霧（ESI）離子源，負離子模式檢測；多重反應監測（MRM）模式；霧化氣體積流量3 L／min；加熱氣體積流量10 L／min；接口溫度300 ℃；脫溶劑溫度526 ℃；加熱塊溫度400 ℃。其他質譜參數見表2，多重反應監測色譜圖見圖1，對照品二級質譜圖見圖2。

表2 各成分質譜參數Tab.2 MS parameters for various constituents

圖1 各成分多重反應監測色譜圖Fig.1 Multiple reaction monitoring chromatograms of various constituents

圖2 各對照品二級質譜圖Fig.2 MS／MS spectra for various reference substances

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關系考察 精密吸取“2.1.2”項下對照品溶液，在“2.2”項條件下進樣測定。以對照品質量濃度為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，并以信噪比S／N≥10 為定量限，結果見表3，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表3 各成分線性關系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度試驗 取表1 中編號2、4、6 的對照品溶液，在“2.2”項條件下進樣測定6次，測得沒食子酸、羥基紅花黃色素A、槲皮素、鞣花酸、西紅花苷Ⅰ、山柰酚、梔子苷峰面積RSD 分別為 0.66%～2.92%、1.04%～2.21%、0.74%～1.99%、2.17%～2.43%、0.98%～2.51%、0.95%～2.76%、1.00%～2.75%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩定性試驗 取同一份供試品溶液，于0、3、6、12、24 h 在“2.2”項條件下進樣測定，測得沒食子酸、羥基紅花黃色素A、槲皮素、鞣花酸、西紅花苷Ⅰ、山柰酚、梔子苷峰面積RSD 分別為2.65%、1.89%、2.45%、2.66%、2.75%、1.82%、1.83%，表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批滴丸，按“2.1.1”項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2”項條件下進樣測定，測得沒食子酸、羥基紅花黃色素A、槲皮素、鞣花酸、西紅花苷Ⅰ、山柰酚、梔子苷峰面積RSD 分別為4.84%、4.03%、2.37%、3.90%、3.61%、3.03%、4.04%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 取各成分含量已知的同一批滴丸藥材粉末6份，加入1∶1 含量比例的對照品溶液（沒食子酸6.84 mg／mL、羥基紅花黃色素A 60.38 mg／mL、槲皮素0.28 mg／mL、鞣花酸5.47 mg／mL、西紅花苷Ⅰ25.55 mg／mL、山柰酚0.24 mg／mL、梔子苷114.50 mg／mL）各1 mL，在“2.2”項條件下進樣測定，計算回收率。結果，沒食子酸、羥基紅花黃色素A、槲皮素、鞣花酸、西紅花苷Ⅰ、山柰酚、梔子苷平均加樣回收率（RSD）分別為96.66%（3.60%）、95.85%（4.03%）、102.98%（2.61%）、101.31%（5.90%）、100.35%（5.69%）、97.50%（4.87%）、104.20%（2.55%）。

2.4 樣品含量測定 取6 批滴丸藥材，按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2”項條件下進樣測定，計算含量，結果見表4。

表4 各成分含量測定結果Tab.4 Results of content dtermination of various constituents

3 討論

本實驗對不同流動相（甲醇?0.1% 甲酸、乙腈?0.1%甲酸、乙腈?10 mmol／L 乙酸銨）、稀釋液（水、30%甲醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇）進行考察，發現70%甲醇稀釋后乙腈?0.1%甲酸洗脫時各成分峰型及響應最優。課題組前期確認，本實驗所測定的7 種成分在負離子模式下響應值優于正離子模式下，其中梔子苷得到1 個羧基而形成m／z433.1［M＋HCOO］－準分子離子峰，并且存在m／z411.1［M＋Na］＋準分子離子峰［9］，而［M＋HCOO］－響應值明顯優于［M＋Na］＋，故確定其母離子為m／z433.1。在負離子模式下，以不同碰撞能量對母離子進行產物離子掃描，取2 對碎片離子作為定性離子對，響應強度最高者作為定量離子對，在此基礎上通過電壓優化來確定最終碰撞能量和離子對。

現代研究表明，梔子含有多種成分，其中環烯醚萜苷、色素為主要活性物質，具有抗動脈粥樣硬化、增強心血管保護作用［10］；廣棗中的酚酸類成分沒食子酸、鞣花酸及黃酮醇類成分槲皮素具有顯著的抗氧化、降血糖、降血脂、抗癌作用［11?12］；紅花中的查爾酮類化合物羥基紅花黃色素A 及黃酮醇類成分山柰酚具有改善心肌缺血、減少腦部栓塞的功效［13］。根據2020 年版《中國藥典》及文獻［14?16］報道，本實驗所測定的7 種成分在乙醇中均有較好的溶解性，故以其為溶劑進行提取。

4 結論

本實驗建立HPLC?MS／MS 法同時測定朱日亨滴丸醇提液中沒食子酸、羥基紅花黃色素A、槲皮素、鞣花酸、西紅花苷Ⅰ、山柰酚、梔子苷含量，該方法快速靈敏，準確可靠，可為該方質量控制提供參考。