‘白蘭地’海棠不同花期與不同花器官的香氣成分分析

周晨晨，范俊俊，譚瑞楠，楊 峰，張往祥

（1.南京林業大學林學院，江蘇 南京 210037；2.金陵科技學院園藝與園林學院，江蘇 南京 210038；3.青島市政監理咨詢有限公司，山東 青島 266000）

0 引言

【研究意義】花香是園林植物重要的觀賞形狀，被譽為花卉的“靈魂”[1]，是植物誘引昆蟲授粉的重要表達信號，也是評價觀賞植物和鮮切花的重要品質指標?；ㄏ銚]發物按照生物合成途徑可將這些化合物分為萜烯類、苯丙酸類/苯環型化合物和脂肪族化合物等3大類[2]?；ㄏ惚然ㄉ突ㄐ透苡绊懴M者的選擇[3]。常見的花卉育種工作大多集中于花型、花色、花期等方面，而忽視了香花的育種[4]。更為多元化的花香研究可以了解植物開花過程中香氣的差異變化，明確花香釋放的關鍵部位，為不同植物花朵香氣形成機理的研究、芳香新品種的培育和后續花香代謝研究奠定基礎，同時也為鮮花加工產業提供科學的指導?！厩叭搜芯窟M展】學者們在對花朵揮發物的鑒定上進行了諸多試驗，對園林植物的花香成分組成進行了研究，包括桂花[5]、蠟梅[6]、蘭花[7]、玫瑰[8]、茉莉[9]等。植物花朵香氣的釋放往往因為開花階段的不同而呈現一定的變化，不同花器官所釋放的香氣也有差異，目前學者對于花香的研究也不局限于簡單的定量定性分析，更多的是研究花朵香氣釋放的部位和規律，以及嘗試尋找花香與花色、傳粉者之間的聯系。比如對水仙花花香的晝夜規律和不同花齡的花香研究發現夜間產生的氣味明顯少于白天，花被結構加倍的復花產生雙倍的香味[10]。從花的不同部位研究了大花蕙蘭“陽光鐘”的揮發性成分，鑒定出23種成分[11]。紅蘋果“佩林戈”的成熟花揮發性氣味分析發現芳樟醇含量最高，在花蕾中為43.0%，在花柱和柱頭頂部空間中為17.6%[12]。以及對桂花[5]、杜鵑[13]、茶梅[14]、野茉莉[15]等植物的花香釋放規律研究，結果都顯示隨著花期的變化花香而呈現不同的變化規律。海棠（Malus）是薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus）中果實直徑較?。ā? cm）的一類植物的總稱，是優良的觀花、觀葉和觀果樹種。目前國內外海棠良種選育工作主要是圍繞觀花、觀葉和觀果等目標性狀展開，鮮見以香花為目標性狀的改良育種研究。中國的傳統觀點是，盛開的海棠花美麗而不芳香[16]。然而，長期的自然選擇和人工育種已在全球范圍內培育出700多個海棠品種[17-19]，其中大多數品種都是芳香的[16]。李曉磊[20]、Omata等[21]和Zhao等[16]基于少數海棠種質花香成分檢測發現海棠花香主要成分是異戊醇、芐醇、3-甲基-4-氧絡戊酸、羅勒烯、庚烷等物質?！颈狙芯壳腥朦c】但這些研究僅僅局限于少量品種的花香定性上，對于海棠花香的釋放規律研究較少。在進行芳香花卉育種或花卉調控，甚至精油提取時，了解植物的花香特性和釋放規律至關重要?！緮M解決的關鍵問題】因此，為了研究海棠的花香釋放規律，針對花量較大、重瓣、花朵呈深粉紅、氣味濃郁的北美海棠品種‘白蘭地’海棠（M.'Brandywine'），本研究采用 SPME-GC-MS 技術對‘白蘭地’海棠的花朵開放過程中（大蕾期、初花期、盛花期、末花期）花香的釋放規律、不同花朵部位（花瓣、雄蕊、雌蕊及剩余部分）的香氣成分進行分析，研究花香特征及釋放規律，為后續海棠花香代謝研究及成分的鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

于2021年4月選取來自國家海棠種質資源庫（揚州市江都區，東經 119°55′，北緯 32°42′）的健康且長勢相近的‘白蘭地’海棠（M.'Brandywine'）作為供試材料，于天氣晴朗的上午7:00～9:00收集‘白蘭地’海棠花朵處于大蕾期（蕾膨大，雌雄蕊即將顯露）、初花期（花朵即將開放，雌雄蕊顯露）、盛花期（花朵完全開放且柱頭和花藥新鮮，色彩明艷）、末花期（柱頭和花藥干萎，花瓣未干萎）的花枝，采摘后及時插入濕沙，帶回實驗室并對每個花期準確稱取4 g花朵進行揮發性成分測定。并且對盛花期的花朵解剖成花瓣、雄蕊、雌蕊及剩余部分（雌蕊、萼片、萼筒），每個部分準確稱取2 g進樣分析。以上試驗均設置3個重復。

1.2 GC-MS分析

選取配有 65 μm PDMS-DVB（二乙烯基苯）萃取頭的固相微萃取儀（Supelco，USA）進行花香成分收集和吸附。萃取頭首次使用時在氣相色譜進樣口中以 270 ℃的高溫活化0.5 h，以后每次進樣前都活化3 min，不同花期樣品每次處理取4 g花朵置于250 mL頂空瓶中，不同花器官樣品每次處理取2 g花朵置于20 mL頂空瓶中，萃取深度約2.5～3.0 cm，于水浴加熱45 ℃條件下頂空萃取35 min后，立即插入氣相色譜進樣口進行解析，每個單元設置3個重復。

氣質聯用儀Trace DSQ （Thermo Fisher Scientific,Waltham, MA, USA）。氣相條件：DB-5MS（非極性柱，長30 m，內徑0.25 mm，液膜厚0.25 μm），載氣為高純He，柱流量1.0 mL·min-1不分流進樣；進樣口溫度250 ℃，熱解析3 min，不分流進樣；起始溫度 50 ℃，保持 1 min，以 10 ℃·min-1升至 100 ℃，不停留，再以 5 ℃·min-1升至 160 ℃，保持 4 min，再以8 ℃·min-1升至220 ℃，不停留。質譜條件：離子源溫度230 ℃，電離方式EI+，電子能量70 eV，檢測器電壓1 200 V，質量掃描范圍：33-450 aMU，全掃描方式，掃描時間0.5 s，傳輸線溫度230 ℃。

1.3 數據分析

將得到的質譜數據與美國國家標準與技術研究所NIST譜庫提供的標準物質的質譜圖進行比對，通過（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）網站進行檢索，同時根據在相同升溫程序下用正構烷烴標準樣品（C8～C20）計算得到科瓦茨保留指數（Kovats’Retention Indices，RI）和NIST網站上對應物質所列舉的相關參考文獻進行進一步定性確認，鑒定出主要揮發性成分。根據離子流峰面積歸一化法計算出樣品中各香氣物質的相對含量。使用Origin 2019b（OriginLab, MA, USA）和 Systat 13（Systat Software Inc., CA, USA）對揮發性成分進行主成分分析（PCA）。

2 結果與分析

2.1 ‘白蘭地’海棠不同花期的揮發性成分分析

‘白蘭地’海棠4個時期的揮發性成分的總釋放量呈現先上升后下降的趨勢，在盛花期達到最高（圖1）。在4個花期中共檢測到50中揮發性化合物（表1），其中大蕾期23種，初花期30種，盛花期30種，末花期32種。這些揮發性化合物主要包括6種萜烯類、15種酯類質、4種醇類、13種烷烴類、9種醛酮類和3種酚類。

表1 ‘白蘭地’海棠不同花期的揮發性成分鑒定Table 1 Identification of volatiles in different flowering stages of Malus Brandywine

圖1 ‘白蘭地’不同花期揮發性成分的峰面積圖Fig.1 Peak areas of Malus Brandywine volatiles at different flowering stages

4個花期檢測出的揮發性成分主要以萜烯類、酯類、醛酮類、烷烴類、醇類和酚類為主，但不同時期的種類構成不完全相同（圖2）。酚類物質只在盛花期和末花期檢測出，在‘白蘭地’海棠花香釋放總量中占的比重極少。萜烯類揮發性成分相對含量在花朵開放過程中先上升后下降，在盛花期達到最高（37.3%），而烷烴類和酯類呈現先下降后上升的趨勢。大蕾期主要成分以醛酮類（38.78%）和烷烴類（22.81%）為主，在整個開花過程中的相對含量最高，萜烯類和酯類的相對含量相差較小。初花期以萜烯類和酯類為主，酯類（24.88%）在初花期達到最高。萜烯類和醛酮類是盛花期花香釋放的主要種類，占盛花期總釋放量的70.88%，而這個時期的酯類和烷烴類成分所占比重在4個時期中最低，酚類物質（4.26%）也主要出現在盛花期。末花期和盛花期花香成分釋放類別種類與相對含量相似，醇類成分在末花期達到最高（9.52%）。

圖2 不同花期揮發性成分種類的相對含量比較Fig.2 Relative contents of volatiles in floral organs at different flowering stages

‘白蘭地’海棠不同花期的揮發性成分組成和釋放量不同。大蕾期的主要成分是葉醇（9.00%）、甲基庚烯酮（14.98%）、乙酸葉醇酯（9.37%）、壬醛（18.48%）、α-法 呢 烯（14.47%） 和 正 十 二 烷（10.46%），在大蕾期的相對含量均高于初花期、盛花期和末花期，其中壬醛在其他3個花期中相對含量較低或極地而無法檢測出。初花期的主要成分是葉醇（7.71%）、己酸甲酯（11.67%）、甲基庚烯酮（10.39%）、芳樟醇（25.19%），這些成分的相對含量高于盛花期和末花期，整體釋放量呈現下降的趨勢。盛花期的主要成分是己酸甲酯（7.12%）、芳樟

醇（14.75%）、(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯（9.74%）和2-十三烷酮（11.44%），雖然盛花期和初花期檢測出來的成分數量相同，但盛花期花香總釋放量（2.49×109）遠高于初花期（1.38×109）（圖1）。末花期的主要成分是甲基庚烯酮（7.56%）、己酸甲酯（7.31%）、芳樟醇（13.05%）、4-亞甲基異佛爾酮（8.56%）和α-法呢烯（7.28%），除了4-亞甲基異佛爾酮，其他主要成分相對含量在4個時期中基本呈現下降趨勢。4個時期中盛花期和末花期的主要揮發性成分組成結構較相似。(E)-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯、對甲苯甲醚和苯乙醇在盛花期和末花期的相對含量均較高，但在大蕾期和初花期均未檢測出，相對含量較高的芳樟醇在除了大蕾期的3個時期均檢測出，且呈現下降趨勢。在各個花期中，共有成分有10種，葉醇、芳樟醇、己酸甲酯、甲基庚烯酮和α-法呢烯等在大蕾期、初花期和盛花期的含量較高（4.40%～25.19%），為‘白蘭地’海棠主要揮發性成分。

2.2 ‘白蘭地’海棠不同花器官的揮發性成分分析

‘白蘭地’海棠不同花器官中雌蕊的揮發性成分的總釋放量最高，花瓣最低（圖3）。在4個花期中共檢測到45中揮發性化合物（表2），其中花瓣28種，雌蕊（含花萼）32種，雄蕊25種。這些揮發性化合物主要包括6種萜烯類、17種酯類質、4種醇類、7種烷烴類、8種醛酮類和3種酚類。

表2 ‘白蘭地’海棠不同花器官的揮發性成分鑒定Table 2 Identification of Malus Brandywine volatiles in floral organs

圖3 ‘白蘭地’不同花器官揮發性成分的峰面積圖Fig.3 Peak areas of Malus Brandywine volatiles in floral organs

‘白蘭地’海棠不同花器官的揮發性成分組成和釋放量不同?；ò曛兄饕煞质羌核峒柞ィ?5.41%）、芳樟醇（10.01%）和辛酸甲酯（13.60%），整朵花中己酸甲酯和辛酸甲酯的釋放主要集中在花瓣。雌蕊中主要成分是葉醇（5.84%）、乙酸葉醇酯（20.47%）、α-法呢烯（34.12%）和（E）-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯（6.03%），其中（E）-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯僅在雌蕊中檢測出，整朵花中乙酸葉醇酯和α-法呢烯的釋放集中于雌蕊。雄蕊中主要成分是甲基庚烯酮（7.75%）、芳樟醇（23.59%）、4-辛烯酸甲酯（12.33%）、苯乙醇（11.04%）和4-亞甲基異佛爾酮（12.06%），其中苯乙醇為雄蕊中獨有的揮發性成分，芳樟醇、4-辛烯酸甲酯和4-亞甲基異佛爾酮的主要釋放也在雄蕊。在不同的花器官中，檢測出的共有揮發性成分共12種，這些成分大多都不是‘白蘭地’海棠的主要揮發性成分，主要成分均集中于某一器官。此外，花器官檢測出的揮發性成分種類與花期有差異，雌蕊中特異成分種類達11種，主要是酯類、醇類和醛酮類物質，這可能是由于花朵解剖造成解剖傷口導致有其他成分被檢測出。

不同花器官的揮發性成分釋放種類構成不同（圖4）。在數量上，3種器官中酯類的成分數量差別最大，最高的是雌蕊（12種），最低的是雄蕊（6種）。在相對含量上，3種花器官差別最大的是酯類物質，最小的是烷烴類?；ò曛袡z測出的揮發性成分種類以酯類（57.86%）、醛酮類（17.85%）和萜烯類（15.63%）為主，占花瓣揮發性成分總釋放量的91.34%。雌蕊中以萜烯類（47.64%）和酯類（41.26%）為主，占雌蕊揮發性成分總釋放量的88.9%。雄蕊以萜烯類（32.09%）和醛酮類（25.68%）為主，占雄蕊揮發性成分總釋放量的57.77%。

圖4 不同花器官揮發性成分種類的相對含量比較Fig.4 Relative contents of volatiles in floral organs

2.3 基于PCA的不同花期與花器官揮發物的差異性分析

為了進一步分析不同時期、不同花器官與揮發性成分之間的差異關系，基于不同花期的50個揮發性成分和不同花器官的45個揮發性成分，對4個時期和3個花器官成分數據進行了主成分分析。

結果表明，對于不同花期與揮發性成分之間（圖5-A），第一主成分（PC1）貢獻率達65.03%，第二主成分（PC2）貢獻率達22.43%，前兩個主成分占總方差的87.46%，說明能很好地反映所測樣品的整體信息特征。在PC1負方向上，甲基庚烯酮、乙酸葉醇酯、壬醛、正十二烷和α-法呢烯的貢獻較大，說明這些成分與大蕾期呈正相關關系。（E）-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯和2-十三烷酮PC1和PC2正方向上的貢獻較大，與盛花期和末花期呈正相關關系，是這兩個時期的主要揮發性成分。己酸甲酯和芳樟醇在PC1正方向上和PC2負方向上的貢獻較大，與初花期呈正相關關系，是初花期的主要成分。4個時期除了盛花期和末花期位于同一坐標象限，其余2個時期分布較為分散，沒有重疊，表明在整個花開放過程中，花香成分釋放存在差異，且盛花期和末花期的揮發性成分組成結構較相似。

圖5 揮發性成分的主成分分析Fig.5 Principal component analysis based on volatiles

對于不同花器官與揮發性成分之間（圖5-B），第一主成分（PC1）貢獻率達到61%，第二主成分（PC2）貢獻率達到37.65%，前兩個主成分占總方差的98.65%，能很好地反映所測樣品的整體信息特征。己酸甲酯、乙酸葉醇酯、芳樟醇和α-法呢烯在PC1和PC2上的貢獻較高，說明這些成分是花器官香氣釋放的主要揮發性成分。其中乙酸葉醇酯和α-法呢烯在PC1的正方向上貢獻最大，與雌蕊呈正相關關系。己酸甲酯、辛酸甲酯和2-十三烷酮在PC2的正方向上貢獻較大，與花瓣呈正相關關系，是花瓣中檢測出的主要揮發性成分。芳樟醇、4-辛烯酸甲酯、苯乙醇和4-亞甲基異佛爾酮在PC2的負方向上貢獻較高，與雄蕊呈正相關關系，是雄蕊中檢測出的主要揮發性成分。3種花器官均位于不同象限，分布較為分散且無重疊，表明不同花器官的花香成分存在差異。

3 討論

相對于花型、花色等植物性狀，花香的研究相對滯后[22]。目前，已鑒定出近100個植物科的2 000多種花香化合物。在這些化合物中，萜烯類化合物是植物花香化合物中最大的一個類群，在許多植物的揮發性成分中占很大比例，它們不僅對植物的氣味有影響，還會對植物花色產生一定的影響[23]。Schiestl等[24]研究發現，萜烯類和苯丙烷類化合物是散發吸引授粉者信號的主要物質。鄒晶晶等[25]發現萜烯類化合物是12個桂花品種中的主要香氣活性物質。章辰飛等研究發現2種杜鵑花中萜烯類物質的組分最多，對花香的貢獻最大[26]。徐瑾等[27]發現菊花進入盛花期后萜烯類物質達到最高，占總香氣成分的37.40%。陳藝荃等[28]對不同品種的雜交蘭香氣研究也發現花香主要成分是萜烯類化合物。程劼等[29]研究發現，萜烯類化合物是薔薇科植物玫瑰精油頭香香氣的重要組成成分，使其具有天然香氣。周圍等[30]對苦水玫瑰油香氣分析也發現單萜類化合物占極大比例。本研究對薔薇科植物‘白蘭地’海棠不同花期的花香檢測中共發現了50種揮發化合物，其中萜烯類物質在初花期、盛花期和末花期均占主導地位，相對含量在盛花期達到最高，占總香氣成分的37.3%。

諸多對植物開花過程中香氣的研究表明，隨著花瓣的展開，植物的花香釋放會發生變化[25-27]。孫亞如等[8]研究發現盛開期是‘單縣玫瑰’油用的最佳采收期。徐瑾等[27]發現菊花在花朵開放過程中香氣成分的種類和含量先增多后減少，均與本研究結果相似。本研究中4個時期分別檢測出23、30、30、32種揮發性成分，4個時期的揮發性成分的總釋放量呈現先上升后下降的趨勢，在盛花期達到最高。其中主要成分芳樟醇在初花期相對含量達到最高（25.19%），隨著花朵的開放與衰敗，芳樟醇釋放量逐漸下降。對不同花期與花香成分之間作PCA后也顯示芳樟醇在PC1正方向上的貢獻較高，雖然釋放量下降，但依然是初花期、盛花期和末花期的主要揮發性成分之一。壬醛和α-法呢烯的在PC1負方向上貢獻較大，與大蕾期呈正相關關系；α-法呢烯在大蕾期之后釋放量開始下降，但其余3個時期相對含量差別較小，而壬醛僅在大蕾期檢測出。PCA結果顯示在整個花開放過程中，花香成分釋放存在差異，且盛花期和末花期的揮發性成分組成結構較相似。

植物香氣的釋放不僅于花期有關，也有花朵的器官組成有關，花香的物質基礎是花朵不同器官產生的易揮發次生代謝產物，花朵各部分對花香釋放的貢獻不是等同的，這種空間差異是普遍存在的[31]。一般認為花瓣是花香揮發物合成及釋放的主要部位[32]，但雄蕊、雌蕊、花萼或者其他部分也可能是主要香氣來源，或者釋放某種具有獨特貢獻的化合物。本研究中在花瓣、雌蕊（含花萼）和雄蕊中分別檢測出28、32、25種揮發性成分。雌蕊的揮發性成分的總釋放量最高，花瓣最低，說明雌蕊可能是整朵花香氣釋放的主要器官?；ò曛兄饕煞质羌核峒柞?、芳樟醇和辛酸甲酯，雌蕊中主要成分是葉醇、乙酸葉醇酯、α-法呢烯和（E）-4,8-二甲基-1,3,7-壬三烯，雄蕊中主要成分是甲基庚烯酮、芳樟醇、4-辛烯酸甲酯、苯乙醇和4-亞甲基異佛爾酮，其中苯乙醇為雄蕊中獨有的揮發性成分。主要成分芳樟醇僅在雄蕊和花瓣中檢測出，其含量在雄蕊中達到最高，雌蕊中并未檢測出芳樟醇?；ㄆ鞴僦袡z測出的共有揮發性成分共12種，但這些成分大多都不是‘白蘭地’海棠的主要揮發性成分，主要成分均集中于某一器官。PCA結果也顯示，己酸甲酯、乙酸葉醇酯、芳樟醇和α-法呢烯等主要成分分別與花朵的不同器官高度相關。

4 結論

葉醇、芳樟醇、己酸甲酯、乙酸葉醇酯、甲基庚烯酮和α-法呢烯為‘白蘭地’海棠主要揮發性成分。隨著花朵開放，揮發性成分的總釋放量呈現先上升后下降的趨勢，在盛花期達到最高，不同時期的香氣成分種類構成不完全相同，主要以萜烯類和醛酮類為主，分別在盛花期和大蕾期達到最高。盛花期花朵雌蕊是揮發性成分釋放的主要花器官，不同花器官的花香成分存在明顯差異。