動植物miRNA 實現跨物種基因調控的研究進展

孟桂智，劉寶寶，李雅輝，馬燕芬，王興平，馬 云，蔡小艷

（寧夏大學農學院/寧夏回族自治區反芻動物分子細胞育種重點實驗室，寧夏 銀川 750021）

microRNA （miRNA） 是一類含有18～24 個核苷酸的內源性非編碼單鏈小RNA 片段，屬于轉錄后水平的調控因子［1］。 研究人員在秀麗隱桿線蟲體內發現了Lin-4， 它只編碼小RNA 而不編碼蛋白質，這類物質后來被稱為miRNA；Lin-4 通過與其靶mRNA 的3′端非編碼區結合抑制靶基因的表達從而發揮作用［2］。 Zhang 等［3］研究發現大米中的miR-168a 能夠被消化道吸收進入肝臟，靶向作用于LDLRAP1，導致小鼠血漿中的低密度脂蛋白含量升高，由此引發人們對跨界miRNA 的研究興趣。 隨后發現， 金銀花中的miR-2911 可以抑制PB2 和NS1 基因的表達從而有效抑制流感病毒的復制，降低小鼠肺組織中的病毒滴度［4］。 隨著研究的不斷推進發現，動物源性的miRNA，如雞蛋中的miRNA 具有跨物種調控人體功能的作用［5］，并且發現牛奶外泌體中的miRNA 有類似功能［6］。 后期也有研究表明動物乳汁外泌體中的miRNA 也具有一定的調控作用， 例如牦牛乳來源的外泌體miRNA 可在缺氧環境中調節腸上皮細胞增殖［7］。與此相關的miRNA 結構、跨物種后穩定性、靶基因結合等方面的研究逐漸增加。 筆者對植物和動物miRNA 跨物種調控的研究進展進行系統和全面總結， 以期為后期深入探究其跨物種功能機制提供參考。

1 動植物miRNA 的結構及結合靶基因的方式

1.1 miRNA 生物合成過程

動物體內編碼miRNA 的基因主要存在于細胞核中，編碼基因首先經RNA 聚合酶Ⅱ或Ⅲ進行轉錄， 形成一個具有特殊莖環結構的初級轉錄本（pri-miRNA），經腺苷酸化后形成多聚腺苷酸尾巴和類似mRNA 的帽子結構。 pri-miRNA 在細胞核內被Drosha 酶剪切后去掉兩邊多余的序列形成miRNA 前體 （pre-miRNA），pre-miRNA 被Exportin-5 轉運蛋白呈遞至細胞質中，在Dicer 的作用下進一步剪切形成具有不完全配對的雙鏈RNA， 最后在RNA 解旋酶的作用下形成成熟miRNA 和miRNA*，成熟miRNA 可與多種蛋白質結合，從而形成miRNA 誘導的復合物RISC，可使基因沉默［8］。

植物中miRNA 的形成過程與動物miRNA 形成略有差異，植物體內不含Drosha 酶，由與其具有相似功能的DCL1 代替， 因此，pri-miRNA 經DCL1 剪切形成pre-miRNA，pre-miRNA 在DCL1酶剪切后形成長度為20 bp 左右的成熟miRNAmiRNA* 雙鏈復合物； 由HASTY （具有類似Exportin-5 轉運蛋白功能）從細胞核轉運到細胞質中，最后在Helicase 酶的作用下形成單鏈成熟的miRNA 并與AGO 等蛋白結合，形成有功能的復合物［1，9］。 動植物miRNA 生成過程雖存在差異，但都形成有功能的復合物發揮其穩定的生物學功能。

1.2 miRNA 結構特點及跨物種存在的穩定性

miRNA 是生物體內普遍存在的一種內源性非編碼單鏈RNA， 其前體具有特殊的發夾結構，這種發夾結構不僅包括傳統的堿基配對形式G：C、A：T（U）配對，還存在大量的G：U 堿基配對。 成熟miRNA 的5′端為磷酸基團，3′端為羥基， 動物的成熟體miRNA 及其前體序列在進化上相對保守，而植物miRNA 僅僅是其成熟體較為保守。 動物miRNA 前體的序列長度為60～80 個核苷酸，而植物miRNA 前體的長度變化較大，從幾十個堿基到幾百個堿基［10-11］。

動植物miRNA 在結構上存在的最大區別是植物miRNA 3′末端具有2′-O-甲基化修飾， 不僅能增強miRNA 的穩定性，還能保護甲基化修飾的miRNA 不會被核酸外切酶降解。 此外，甲基化修飾的miRNA 對氧化劑高碘酸鈉具有抗性［12-14］，因此，可利用這一特性區分動植物miRNA。 甲基化修飾的miRNA 不易被降解， 體現在植物miRNA跨物種存在于動物體內，例如用地黃水煎劑灌喂小鼠，在小鼠的血液中發現了地黃源性的miRNA［15］。通過模擬人類消化系統處理煮熟后的大米和大豆， 雖然大米和大豆源性的miRNA 含量存在衰減，但仍然具有生物學活性［16］，這一現象的發生主要是因為植物中的miRNA 具有甲基化修飾，對熱穩定，并且耐受消化道的酸性環境，動物采食消化后被小腸上皮細胞吸收側吸收， 通過上皮細胞分泌側分泌的囊性小泡或外泌體進入血液， 從而到達動物的多個器官［17-18］。

外泌體（exosomes，Exos）是由部分未被溶解酶降解的多囊體與細胞質膜相融合， 使得多囊體中的小囊泡胞吐到細胞外的物質［19-20］。 外泌體可以包被蛋白質、miRNA 和mRNA， 被外泌體包被的miRNA 比游離的miRNA 穩定性更強，用核糖核酸酶處理外泌體，其標志基因CD24 和GAPDH 的表達產物仍能被檢測到， 說明外泌體包被可保護miRNA 不受RNase 降解［13，21］。 外泌體的膜成分與其起源的細胞具有一定的同質性，使得外泌體的信號傳遞具有一定的特異性，在細胞凋亡、腫瘤遷移、病毒擴散、免疫調控等方面都有重要作用［22-26］。 例如母乳中的miRNA 被微泡或外泌體包被，可抵抗核糖核酸酶、凍融循環和低酸堿度（pH=1）。 對牛乳進行巴氏消毒處理前后miRNA 基本保持不變，說明乳中miRNA 仍然具有活性，可參與調節嬰兒免疫系統發育［27-29］。 盡管外泌體是生物體內細胞間通信和母嬰間通信的工具， 但它們也會被運輸到完全陌生的物種體內特別是在人體內， 例如結腸癌細胞（Caco-2）主要通過內吞作用有效吸收牛奶外泌體［30］。這一現象的發現為miRNA 可跨物種調控提供了理論支持。

1.3 miRNA 與靶基因的結合方式

miRNA 主要通過與靶mRNA 結合調控靶基因的表達。 在植物中，miRNA 與mRNA 幾乎完全互補配對，miRNA 主要通過5′端的2～8 位堿基與其靶mRNA 互補配對［31］。 當植物miRNA 和目的mRNA 配對不完全時，miRNA 會抑制目的mRNA的翻譯，當miRNA 與mRNA 完全互補時，引起目的mRNA 在互補區域內發生特異性斷裂， 剪切發生在miRNA 的5′端到3′端第10～11 位核苷酸，mRNA 被降解后失去編碼蛋白質的功能， 從而導致基因沉默［32-34］。 在動物中，多數miRNA 以不完全互補方式與其靶mRNA 的3′UTR 區結合，從而阻礙該mRNA 的翻譯， 但不影響mRNA 的穩定性［35］。

動物miRNA 主要作用于靶mRNA 的3′UTR區， 從而通過改變靶mRNA 上核糖體密度或特異性降解新合成的多肽鏈抑制mRNA 的翻譯，此外，miRNA 還有可能作用于靶mRNA 的5′UTR 區發揮功能［36］。與動物miRNA 相比，植物miRNA 與靶mRNA 的轉錄區基本上為完全互補， 其作用方式主要是使靶mRNA 降解從而抑制mRNA 翻譯，但也存在例外， 如植物中的miR-172 與其靶序列AP2 mRNA 雖然高度互補， 但引起AP2 蛋白表達受抑，而AP2 mRNA 的水平沒有降低［37］。

動植物miRNA 跨物種調控的方式可能存在些許差異， 例如在植物miR-168a 跨界調控動物肝臟LDLRAP1 蛋白的表達中，miR-168a 發揮作用的方式與哺乳動物miRNA 相似， 但miR-168a與LDLRAP1 編碼區靶基因序列近乎完全互補，這又顯示它的作用方式類似植物miRNA，說明當植物miRNA 可以跨界調控動物時， 結合了動植物miRNA 的作用方式［3］。 動物miRNA 跨物種調控主要是因為動物中的部分miRNA 具有同源性，因此，它們的作用方式主要是動物miRNA 的作用方式， 例如miR-148a 是提高奶牛產奶量的馴化基因， 并且與人類miR-148a 的核苷酸序列完全相同， 允許牛奶和消費者基于miRNA 的跨物種交流［6，38-39］。

2 動植物miRNA 發揮類似的生物學功能

動植物miRNA 均能參與調節細胞生長分化、生物個體發育、組織分化、控制細胞增殖和凋亡、病毒感染、能量代謝、免疫應答、疾病發生發展等。正是由于動植物miRNA 可發揮類似的生物學功能，動植物miRNA 可跨物種調控才成為可能。

2.1 細胞分化

動物中miR-17 和miR-20a 均能有效促進C2C12 成肌細胞和原代牛衛星細胞的分化，miR-18a 可能在C2C12 細胞分化中起負調控作用，而miR-19 和miR-92a 對細胞分化的影響不大［40］；植物miR-172 通過靶向作用APETALA2 類基因參與調控植物開花誘導、花器官形態、果實成熟、葉片和根生長等各器官的發育過程［41］。

2.2 細胞增殖與凋亡

動物miR-138-5p 靶向作用于PD-L-1 抑制乳腺癌細胞的增殖和運動，誘導細胞凋亡［42］。植物miR-319 調控TCP 轉錄因子參與多種發育途徑，包括葉片發育和衰老、器官彎曲、激素合成和信號轉導等，其中，TCP4 參與調控細胞增殖，當TCP4活性的小幅增加通過顯著減少細胞增殖實現時，對葉片細胞數量有直接影響［43］。

2.3 免疫應答

動物miR-181a 可能通過TLR4 受體通路調節細胞因子的表達， 進而參與抗血吸蟲感染的免疫調節［44］； 棉花miR-477 通過靶向作用于GhCPB60A 提高對黃萎病的抗性［45］。

3 動植物miRNA 跨物種后具有組織特異性

植物miRNA 跨物種進入動物體內具有一定的組織特異性，miRNA 通過胃腸道進入動物體后通常存在于組織和體液中， 表達豐度低， 在宿主miRNA 中僅占0.001%［46］。 6 名健康受試者連續食用5～7 d 的素食， 發現糞便中的植物源性miR-168 水平明顯升高，在淺層黏膜、結腸黏膜和腹水中檢測到植物源性miR-168［47］。 給小鼠飼喂甘藍后，miR-172 在不同器官中的范圍為0.05%～4.50%，在胃腸道、血液、脾臟、肝臟和腎臟中均可檢測到，在胃中最高可被吸收4.5%［48］。 給豬飼喂新鮮玉米后， 血清和組織中可檢測到玉米miRNA，血清中玉米miRNA 濃度在0.01～0.15 fmol/g，心臟、肝臟、脾臟等組織中的濃度為0.001～0.500 fmol/g［49］。 灌喂人工合成玉米miR-164a-5p、miR-167e-5p 和miR-168a-3p 24 h 后， 豬組織中3 種玉米miRNA 濃度在0.05～0.80 fmol/g；各組織間玉米miRNA 含量存在差異，miR-164a-5p 在眼肌中含量最高（0.21 fmol/g），在肺臟中最低（0.11 fmol/g），miR-167e-5p 在心臟中濃度最高 （0.79 fmol/g），在背部皮下脂肪中最低（0.16 fmol/g）［50］。 這一現象的發生可能是由于植物囊泡上的糖蛋白與微囊泡細胞的表面相容性差［51］。

人飲用牛奶后血液中牛乳外泌體含量升高，表明通過腸道上皮細胞可100%運輸牛乳成分，并在血液中停留長達9 h，在肝臟和脾臟等器官停留長達24～48 h［30］。 牛乳外泌體中的miRNA 可以進入人類的循環系統［52］。 在小鼠模型中的時間進程分析表明，在攝入后3 h，外泌體miRNA 仍分布在肝臟、脾臟、心臟和肺中［53］。 以上研究表明植物miRNA 跨物種進入動物體內的組織特異性更高，而動物miRNA 組織特異性不是很明顯，但存在時間較長，兩者都可穩定存在。

4 動植物miRNA 跨物種調控的研究進展

早期研究發現，細胞可分泌miRNA 并進入受體細胞進行基因表達調控這一 “跨界調控”［2］，后期研究發現食源性miRNA 可靶向作用于動物mRNA 從而發揮重要作用。

4.1 植物源性miRNA 跨物種調控

植物miRNA 跨物種調控目前已有很多報道，例如中草藥、西藍花、大豆、苜蓿、辣木等植物中的miRNA 均有跨物種調控的作用，主要涉及對癌癥以及病毒的調控。

中草藥洪景天中的HJT-sRNA-m7 可與該草藥煎液中的油溶性化學物質形成復合脂質體，促進HJT-sRNA-m7 在細胞中的攝取， 中藥煎液中的衍生物可能會與sRNA 形成脂質體復合物，從而進入肺泡和胃細胞， 有效減少纖維化標志基因和蛋白在體外肺泡細胞和體內小鼠肺組織的表達［54］。 有研究發現，金銀花中的miR-2911 可以抑制SARS-CoV-2 病毒復制， 加速感染者的陰性轉化； 首先在細胞層面使miR-2911 過表達，用SARS-CoV-2 感染細胞24 h 后，定量分析發現，與對照組相比miR-2911 抑制了93%的病毒復制，說明金銀花湯中的miR-2911 可以抑制SARSCoV-2 病毒的復制；隨后評估了金銀花湯中miR-2911 對新冠肺炎患者陰性轉化率的影響， 將75例中度新冠肺炎患者分為兩組， 一組為金銀花湯組 （miR-2911+）， 另一組為傳統的中藥治療組（miR-2911-），miR-2911+組的7 d 陰性轉化率為83.3%；說明金銀花湯中的植物miR-2911 可以抑制SARS-CoV-2 病毒復制并加速感染者的陰性轉化，并且有極大可能幫助治療感染，阻止新冠肺炎大流行［55-57］。 辣木植物中的miRNA 可誘導減少細胞內HIV p24 蛋白和病毒DNA 整合，降低病毒的感染率［58］。

西藍花中高表達的miR-156a 能結合至JAM-A 蛋白的3′UTR 區抑制鼻咽癌細胞株上皮間充質轉化［59］；苜蓿miR-5754 和大豆miR-4995通過靶向作用于腫瘤相關的長非編碼RNA 轉移相關的基因MALAT1 和NET 1 減少癌細胞的產生［60］；植物miR-159 的合成模擬物能夠通過靶向編碼Wnt 信號轉錄因子的TCF7 抑制哺乳動物癌細胞增殖［61］； 植物源性miR-156a 通過靶向作用Wnt/β-catenin 通路中Wnt10b 抑制哺乳動物腸上皮細胞的增殖［62］； 此外， 還發現植物源性miR-167e-5p 通過下調β-連環蛋白的基因和蛋白水平抑制哺乳動物腸上皮細胞增殖［63］。 這些現象都表明植物miRNA 可跨物種調控，為后期治療疾病或提高免疫力提供新的思路。

此外，有研究發現植物miRNA 還可以通過母體傳遞給胎兒。 通過qPCR 在小鼠胎兒中也發現了植物miRNA，說明miRNA 可能通過胎盤轉移至胎兒［64］。研究者對金銀花miR-2911 和流感病毒的成熟miRNA 進行追蹤， 結果發現母體血漿中miRNA 均顯著增加，在胎兒中也顯著升高，說明miRNA 可以通過胎盤轉移至胎兒，可為胎兒健康發育和治療母體子宮疾病提供一種新的研究策略［64］。 熊貓乳汁外泌體中存在竹子源性miRNA，并且通過靶基因富集分析發現表達量排名前十位的外源性miRNA 主要參與基本的細胞代謝和神經發育，表明外源性miRNA 在大熊貓幼仔出生后的發育過程中發揮潛在作用［65］。 給妊娠90 d 的經產金華母豬飼喂玉米后，在母豬血清、肝臟和胎兒肝臟、 脾臟等組織中均能檢測到玉米miRNA，說明母豬采食玉米后玉米miRNA 可傳遞給胎兒［13］；在泌乳期母豬的乳汁外泌體中也檢測到了植物miRNA［66］。

4.2 動物源性miRNA 跨物種調控

動物miRNA 跨物種調控主要是人通過采食動物性產品例如牛奶和雞蛋， 參與調控以及在一種動物體內發現另一種動物的miRNA 調控。

乳汁中的miRNA 主要通過外泌體進入人體，并進入循環系統發揮作用。 例如母乳中的miR-223 可靶向作用T 細胞和粒細胞群對嬰兒免疫系統產生作用［52，67］；妊娠期間大量攝入牛乳中的必需支鏈氨基酸和miR-21 會使得胎盤和胎兒過度生長［68］； 雞蛋攜帶的miRNA 可進入人的外周組織，影響外周血單核細胞中的基因表達［5，51］。 豬乳外泌體miRNA 通過抑制小鼠腸上皮細胞中的TLR4/NF-κB 和p53 通路減弱LPS 誘導的細胞凋亡，從而保護腸上皮細胞免受LPS 誘導的損傷［69］；水牛的牛奶外泌體衍生的miRNA 與免疫反應和代謝過程有關［70］。

5 展望

通過以上論述發現，動植物miRNA 由于自身的特殊結構或外泌體的包被， 被動物吸收進入攝食者體內仍具有一定的穩定性和組織特異性，且可跨物種調控攝食者的靶基因表達和生理功能。植物中的小分子物質對于攝食者是否都發揮正向調控作用或展現出積極的一面， 目前尚未完全闡明，因此，需要更多的研究驗證。 目前已有研究表明在服用中草藥后可提高機體抵抗力或治愈疾病， 這一作用機制可從植物跨界調控這方面的研究進行闡述，但在動植物跨界過程中，攝食者的個體差異對于跨物種調控的影響有多大， 目前的研究還較少，需要更多深入的研究進行闡明。動植物miRNA 可跨界調控的研究有重要意義： 一方面，在植物分子育種中通過選育特定高表達植物miRNA 的新品系或新品種，可充分利用自然界豐富的遺傳資源， 使遺傳物質在植物和動物之間進行交流，為植物分子育種提供新思路和新方向；另一方面，動植物miRNA 可在攝食者體內穩定存在并發揮作用，提取這些特殊的miRNA 或人工合成miRNA 可用于治療疾病和補充營養，改善動物生產性能，其應用潛力和價值值得深入探討。 為此，對動植物miRNA 的調控功能進行更全面深入地了解， 將對疾病治療和提升動物生產性能有重要作用。