BRD4功能及其抑制劑研究進展

田杰怡，吳燾

(江蘇省腫瘤發生與干預重點實驗室，江蘇 南京 210009)

0 引言

關于BRD4的研究源遠流長，從最初的只被鑒定為一種細胞周期控制蛋白，而對其是否具有其他功能尚不明確，到如今BRD4的不同亞型被證明在調節與腫瘤發生相關的基因轉錄中具有相反的活性，這反映出BRD4作為一個藥物研究靶點的重要性和其小分子抑制劑開發的可觀前景。

1 結構和功能

BRD4即溴結構域蛋白4，和BET家族的其他幾位成員一樣，具有較為保守的結構：都有兩個BRD和一個末端結構域。

其中，BD1和BD2與乙?；R別有關。兩者相互串聯，它們不僅與啟動子和超增強子區域結合以調節基因表達，而且在幾種人類癌癥中促進轉錄。通過抑制BRD4，超增強子區域和癌基因的目標啟動子之間的通信通路可以縮短，SEs和目標啟動子之間的通信變得快捷，導致癌基因表達的細胞受到特異性抑制，最終導致癌細胞的死亡。

2 BRD4在癌癥中的作用及重要性

由于細胞的表觀遺傳狀況因譜系的不同會有很大差異，轉錄共激活因子如BET在不同種的癌癥中也可能會有不同的靶點，這有可能影響BET抑制劑的活性和作用機制。

2.1 肺癌

BRD4作為BET家族中被廣泛研究的一員，主要在轉錄調控中發揮作用。Lockwood及其團隊用BET抑制劑JQ1治療了一組肺腺癌(LAC)細胞株，發現其中一個亞組對BET抑制敏感。與血液瘤相比，JQ1通過一種獨立于c-Myc下調的機制抑制LAC細胞。通過基因表達譜的分析，他們發現JQ1以劑量依賴性的方式抑制致癌轉錄因子FOSL1及其靶基因[1]。而在小細胞肺癌(SCLC)中，Lenhart和伙伴們發現50%的SCLC中存在ASCL1過表達現象，JQ1處理雖對c-Myc蛋白表達沒有影響，但會導致轉錄因子ASCL1的下調。BET溴結構域抑制劑JQ1通過隔離BRD4來阻止其與ASCL1增強子的對接來抑制SCLC，同時，染色質免疫沉淀研究，即COIP實驗，也證實了BRD4與ASCL1增強子的結合[2]。其實，也有研究者認為c-Myc是SCLC中JQ1作用的功能靶標，c-Myc在晚期SCLC中的高表達以及預后較差與BRD4相關[3]。

除了JQ1之外，其他的溴結構域抑制劑在肺癌中的功能作用也在被研究，而且令人驚訝的是，BRD4的功能也許不止于目前人們已經有所了解的轉錄調控、修復一同維持端粒的穩定性等等，還發揮著轉錄之外的作用。比如，溴結構抑制劑ABBV-075 通過誘導caspase-3/7活性，造成SCLC細胞的凋亡。有研究表明，ABBV-075對促凋亡蛋白BIM的表達有微弱的促進作用，并抑制抗凋亡蛋白BCL2的表達。此外，BET抑制增加了BCL2-BIM復合物，從而引發細胞凋亡。除此之外，同時使用BET抑制劑和BCL2抑制劑venetoclax (ABT-199)處理細胞的時候，不論體外和體內都可以觀察到很強的協同作用[4]。

在肺癌當中，非小細胞肺癌(NSCLC)里目前已經發現致癌驅動突變，這使得分子靶向治療變得可行。而與之相反但的是，SCLC與目前的靶向致癌突變無關，相反，它主要與TP53和RB1的失活、c-Myc表達的上調、以及異常組蛋白修飾相關。這些發現表明，表觀遺傳的失調也許在這種癌癥的發生發展中發揮著重要作用[5-8]。在過去的30年里，標準化療聯合放療一直是SCLC的典型治療選擇。SCLC患者一般對初始治療反應良好，然而大多數患者最終死于復發性疾病。所以，小細胞肺癌(SCLC)迫切需要新的治療策略，除了單獨使用JQ1之外，其聯合治療方案在近幾年也收獲了許多新思路。比如：在肺癌中(小細胞肺癌與肺腺癌)，JQ1與HDAC6 的抑制劑ACY-1215 的聯合治療可以顯著抑制腫瘤生長。值得注意的是，ACY-1215目前正在多個臨床研究中測試用于多發性骨髓瘤和淋巴瘤的治療，而JQ1由于其毒性，在臨床研究中使用受到限制。結合ACY-1215和JQ1可以做到在當前SCLC和既往NSCLC的治療中使用較低劑量的JQ1。優化劑量的ACY-1215和/或JQ1結合不同的給藥方法，很可能可以在毒性降低的情況下獲得類似或更好的治療結果，這些發現可以轉化為SCLC患者[9]。溴結構域抑制劑與PD-1抗體可以協同治療KRAS突變的肺腺癌患者。實際上，KRAS突變在大約30%的人類肺腺癌中存在，盡管近期靶向治療的進展顯示出了很大的希望，但KRAS的有效靶向治療方案仍未出現[10]。KRAS突變體難愈的原因是免疫抑制機制，如腫瘤中抑制性調節性T細胞的出現增加，腫瘤浸潤性T細胞抑制性受體PD-1的表達升高。使用BET抑制劑治療血液系統惡性腫瘤是有益的，并且它們在非小細胞肺癌(NSCLC)模型中具有treg破壞作用。通過PD-1抗體阻斷靶向PD-1抑制信號在肺癌中也有實質性的治療效果，盡管這些結果局限于少數患者。于是，Adeegbe假設BET溴化域抑制劑JQ1可以與PD-1阻斷劑協同作用，促進肺癌的抗腫瘤反應。結果顯示，兩者聯用的確具有協同作用，腫瘤浸潤性treg的數量也得到減少。

2.2 乳腺癌

三陰性乳腺癌通常具有較強的侵襲性，Andrieu及其團隊報道了一個包括BRD4和Jagged1/Notch1 (配體/受體對)的信號通路，該通路在維持三陰性乳腺癌的遷移和侵襲中發揮重要作用。他們首先通過Transwell實驗，分別用(S)或(R)-JQ1預處理人乳腺癌細胞株3小時，然后用系統進行測試。其中，(S)-JQ1是一種廣譜的BET -溴化域抑制劑，靶向BRD2, BRD3和BRD4，以非活性對映體(R)-JQ1作為陰性對照。緊接著，他們在對照組和BRD4缺失的乳腺癌細胞株中進行了基因表達分析，并選擇了一組涉及遷移和入侵調控的46個基因。他們發現，在MDA-MB-231細胞中，敲除BRD4可導致7個基因表達顯著改變，其中下調量最大的基因是JAG1，它編碼Notch受體家族的典型配體Jagged1蛋白。進一步的，他們發現BRD4可以調節控制Jagged1蛋白表達以及Notch1的信號轉導，但是BRD2和BRD3并不具備這項能力。BRD4能夠抑制Notch1的活性，阻礙乳腺癌的侵襲轉移。以往研究表明，BET抑制劑會抑制BCL-2或BCL-XL的蛋白表達，而三陰性乳腺癌中BET抑制劑誘導凋亡的關鍵靶點是MCLL[11]?；诎┌Y基因組圖譜(TCGA)數據集，歐陽和他的團隊發現一些自噬相關蛋白，例如AMPK在乳腺癌中顯著下調?；诿庖吖渤恋韺嶒灥慕Y果，BRD4可能與AMPK存在相互作用，進而引起其下調，反之，BRD4抑制劑能夠誘導AMPK調節自噬相關的細胞凋亡[12]。

2.3 白血病

在AML細胞中，已經有豐富的研究表明BRD4是其不同亞型的重要治療靶點。小分子抑制劑，如JQ1和I-BET，可以破壞 BRD4向染色質的招募，導致關鍵癌基因的下調，特別是細胞-骨髓細胞增生癥癌基因c-Myc、BCL2和CDK6。這導致P21腫瘤抑制因子的重新激活，導致許多(但不是全部)血液細胞系和惡性原發細胞的細胞周期停滯和凋亡，特別是那些MLL基因重排的細胞[13-16]。Stewart及其伙伴的研究首次表明JQ1對 (OCI)-AML3細胞系具有活性，該細胞系攜帶了一些在AML中高度發生的基因突變。據了解，這些基因通常與一些低風險的疾病相關。他們發現，與其他已知的激活P53的化合物聯合治療，即組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑，Nutlin-3和羅紅霉素，都可以增強JQ1在OCI-AML3細胞的藥效，表明JQ1誘導的細胞死亡是通過P53介導的途徑，似乎涉及一種caspase 3/7依賴機制。此外，我們發現BRD4與激活的P53相關，這表明JQ1抑制BRD4可能導致染色質招募P53失敗，導致DNA損傷無法修復、細胞周期阻滯乃至細胞死亡等等。研究人員發現當用組蛋白去乙?；?HDAC)抑制劑，NUTLIN-3和化療藥多柔比星和JQ1聯用時，后者的藥效都得到增強。這些化合物對P53活化的誘導證明了JQ1可使AML細胞對P53介導的細胞凋亡敏感。在進一步的研究中，實驗人員們發現BRD4與乙?；膒53相關，但這種相互作用并不會被JQ1所抑制，這表明二者之間的這種蛋白-蛋白相互作用并不涉及乙?；嚢彼崤c溴結構域相互結合。相反，他們認為在OCI-AML3細胞中，當JQ1激活P53后，可以不依賴于c-Myc阻止BRD4介導的P53被招募到染色質靶點，從而導致細胞周期阻滯和凋亡[17]。根據最近的報道，Huang認為BRD4的激活與NPMc+和AML細胞的自噬存在相關。為了證實這一猜想，該團隊對BRD4對自噬過程中幾個關鍵基因的表達的調節作用。已知活性氧的過度生成可激活自噬[18-21]。ROS生成增加可能是由于氧化代謝引起的ROS過度生成和/或Nrf2介導的抗氧化防御能力下降。先前的一項研究表明，BRD4抑制Nrf2介導的抗氧化基因表達，很可能是通過增強Nrf2泛素連接酶Keap1的表達，從而增加ROS水平。本研究中對BRD4在自噬激活過程中，對一系列重要基因包括ATG3、ATG7和CEBPβ的調控作用進行了詳細討論[22][23]。

自BRD4作為表觀遺傳調控因子被發現以來，關于它的靶基因及相關的信號通路的研究層出不窮。最近的研究提出了一種模型，BRD4作為支架，通過蛋白-蛋白直接相互作用招募多種調節蛋白，如造血轉錄因子CEBPβ[24]。

通過BRD4- CHIP -Seq對BRD4進行全基因組檢測，發現BRD4定位于CEBPβ的啟動子和增強子區域，并與其他幾個自噬相關基因存在相互作用，表明CEBPβ在自噬中起著不可或缺的作用。進一步研究發現，CEBPβ缺失后Atg3和Atg7表達顯著減少。這些數據與Roe等人獲得的數據一起表明，BRD4作為上游調控因子，負責將CEBPβ招募到核心基因中，使某些細胞類型實現自噬[25]。另外值得注意的是，Jang的團隊發現促生存自噬是AML LSCs對JQ1耐藥的機制之一。靶向AMPK/ULK1通路或抑制自噬可能是對抗AML和其他類型癌癥對BET抑制劑耐藥性的有效治療策略[26]。

2.4 肝癌

肝細胞癌(HCC)是第五大常見癌癥，也是癌癥相關人類死亡的第二大原因[27][28]。有研究發現，在HepG2細胞中，JQ1會抑制c-Myc蛋白表達，誘導細胞周期阻滯在G1期，引起P27上調，還能阻止BCL2L11蛋白的表達。引入3‘-UTR突變體BRD4可阻斷miR-608誘導的HepG2細胞中的c-Myc下調和增殖抑制[29]。

3 抑制劑種類

表觀遺傳蛋白一直以來都是藥物研究過程中值得關注的重要靶點。迄今為止，關于已有的表觀遺傳蛋白的研究結果大多聚焦在染色質修飾酶這一部分，即所謂的表觀遺傳“書寫者”和“橡皮擦”。而與組蛋白結合有關的相關蛋白的有效抑制劑一直沒有被系統地描述過。

3.1 非選擇性抑制劑

JQ1可以說是最早的BRD4小分子抑制劑，它通過競爭性結合乙酰賴氨酸識別基序發揮作用。JQ1和BRD4蛋白之間的這種競爭作用，在依賴BRD4的癌細胞系中可以產生特異性的抗增殖作用。

Filippakopoulos的團隊進行了差示掃描熒光法(DSF)實驗發現，(+)-JQ1 JQ1的結合是具有一定而選擇性的。因為只有BET家族溴結構域的熱穩定性得到顯著提高，而BET家族以外的溴域沒有。與之相比，其異構體與任何溴域都沒有明顯的相互作用。除此之外，他們還明確了JQ1的結合方式，他與乙酰賴氨酸的結合類似于在乙酰賴氨酸復合物中觀察到的相互作用，即三唑環與進化保守的天冬酰胺(BRD4中的Asn140和BRD2中的Asn429)形成氫鍵[30]。但由于JQ1有很多的副作用以及容易產生耐藥性，目前它主要作為化學探針探究BRD4的機制與功能。

近幾年，不斷有研究團隊嘗試對它的結構進行優化，或者提出新穎的聯合治療策略來對它的藥效進行改善。比如：用氯原子取代苯環對位后，可以同時減小不良反應并提高對BRD4的選擇性[31]。另外，如果用一些極性基團取代側鏈的取代基替，可以顯著增高其活性，如化合物OTX-015，目前已獲批進入臨床Ⅰ期試驗階段[32]。

而且自最初的報道以來，除JQ1之外，還有報道其他幾種具有不同化學型的，但具有類似的結合親和力、選擇性譜和細胞活性的強效選擇性BET抑制劑。更重要的是，超過12種溴化域BET抑制劑已經進入臨床試驗[33-36]。

3.2 雙重抑制劑

隨著第一個BET溴化域小分子抑制劑JQ1的開發，人們能夠證明通過與BRD4結合來取代染色質中的BRD4可以中斷該蛋白的生物學功能。最初，Ember和伙伴們在利用BRD4的第一個溴域對激酶抑制劑文庫進行共結晶篩選的過程中，識別并表征了14種激酶抑制劑(10種不同的化學支架)作為KAc結合位點的配體。其中，PLK1抑制劑BI2536和JAK2抑制劑TG101209對BRD4表現出最強的抑制潛能，對BET溴化域具有較高的選擇性。比較結構分析發現，KAc結合位點的激酶鉸鏈結合支架具有明顯不同的結合模式，這也提示了BET蛋白是多種激酶抑制劑的潛在脫靶蛋白。除了KAc識別功能，含BRD的蛋白也被認為是非典型激酶，Ember和伙伴們發現強有力的周期蛋白依賴激酶(CDK)抑制劑dinaciclib結合到BRDT-1的KAc識別位點，它們與激酶抑制劑相互作用的潛力被發現。通過對BI2536和TG101209與BRD4的不同結合模式的研究，KAc位點為激酶抑制劑的鉸鏈結合組提供了主要的錨點得以確證。這一發現促使他們提出假設，即普通激酶抑制劑(“鉸鏈結合劑”)具有以前未被認識到的潛力作為BET蛋白抑制劑。而以上的這些發現又為合理設計下一代BET選擇性和雙活性BET激酶抑制劑提供了一個新的結構框架。

隨后有研究報道，雙PI3K-BRD4抑制劑可以阻斷C-MYC癌基因的表達，同時在體內顯著抑制肝細胞癌和神經母細胞瘤中的癌細胞生長和轉移。這暗示了，也許重要的細胞周期調節劑Polo樣激酶1 (Polo-like kinase 1, PLK1) 可以與BET在包括前列腺癌和急性髓細胞白血病在內的多種癌癥中產生協同抑制作用，無疑為開發有效抑制BRD4和PLK1的雙抑制劑化合物提供了可能性。除此之外，后續發現的多種激酶抑制劑，包括PLK1抑制劑，BI-2536，和JAK2抑制劑，TG101209對BET蛋白家族表現出中等至優異的抑制活性，這些化合物可以等效地靶向激酶和BET蛋白。張煒教授團隊通過對小分子化合物BI2536進行結構修飾，得到了能同時有效抑制BRD4/PLK1的雙抑制劑化合物UMB160以及能選擇性抑制PLK1的化合物UMB131[37-42]。

對所有BRD4配體配合物的分析和與現有激酶抑制劑配合物的比較表明，激酶抑制劑對KAc位點的四種一般結合模式。根據各自鉸鏈結合基團建立的相互作用模式，抑制劑被分為N型，PZA型(如：GW612286X和BI2536)，ZA型(如：化合物SB251527和SB284847B)，Ⅰ型(如：化 合 物SB610251B、SB614067R和SB202190、LY294002)[43][44]。

3.3 選擇性BD1/2抑制劑

前文所描述的第一代BET抑制劑做到了特異性抑制BET家族，不作用于其他溴結構域。但是在BET家族內部的特異性無法達到。目前研究已知，有兩個可以特異性抑制BD1或BD2的抑制劑，分別是：RVX-208 and ABBV744。

研究表明，處于穩定狀態時的基因表達主要需要BD1，而炎癥刺激誘導的基因表達需要所有BET蛋白的BD1和BD2的參與。而在很大程度上，BD1抑制劑可以產生的效用和廣譜的 BET抑制劑相似，而BD2抑制劑主要在炎癥和自身免疫性疾病中扮演重要角色。

研究者們通過熱變性評估RVX-208的結合發現，與JQ1一樣，RVX-208增加了所有BET 溴結構域的Tm值卻沒有與其他6個蛋白(CREBBP、p300等)的溴域結合，這表明RVX-208的結合對BET蛋白的溴域具有選擇性。

ABBV-744，這是一種具有類藥物特性的BET家族蛋白BD2結構域的強效選擇性抑制劑。ABBV-744有效抑制了BET家族蛋白的BD2結構域，與BRD2、BRD3和BRD4的BD1結構域相比，ABBV-744的選擇性超過290倍，與BRDt的BD1結構域相比，ABBV-744的選擇性超過95倍。

4 總結

BET抑制劑開啟了癌癥治療中表觀遺傳藥物的新時代。隨著時間推移，來自BET抑制劑I/II期研究的臨床數據積累得也越發豐富。雖然BET抑制劑在表現出強有力的抗腫瘤活性，但其毒性應謹慎管理。而耐藥性和毒性的存在也表明需要開發耐受良好的BET抑制劑，并在不超過毒性閾值的情況下最大化臨床療效。

除了已經描述的BET抑制劑，當前的技術進步導致了替代BET抑制劑分子的發展。含有JQ1抑制劑和聚合物化合物作為載體的納米顆粒具有更高的等離子體穩定性，克服了JQ1半衰期短的局限性。這些裝載jq1的納米顆粒在體外和體內均對TNBC具有活性。新技術導致BET-PROTACS的發展，這是一種針對結合BRD4并導致其蛋白酶體降解的嵌合分子的蛋白水解技術[45]。

總的來說，對BET抑制的廣泛關注導致了通過間接途徑產生BET蛋白抑制的非常規藥物的開發。