不同發酵方式對淡豆豉品質及風味的影響

趙超凡，吳姍姍，趙文俊，彭 東，黃俊源，杜 冰，黎 攀

（華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642）

淡豆豉是以黑豆為原料經發酵而得的具有藥食同源性質的食品，具有降血脂、抗抑郁的功效，與納豆（黃豆發酵）具有相似的生理功能[1]，但發酵所用原料及菌株不同。黑豆的蛋白質含量高達36%～40%，同時含有豐富的黃酮類成分，如異黃酮、花色素、黃酮醇、雙黃酮、查耳酮、二氫黃酮等活性成分[2]，經發酵后其活性物質的含量及構成發生改變。此外，淡豆豉具有一定的溶栓酶活性，該酶有益于減少血栓的形成[3]。

近年來，國內對于淡豆豉的研究主要集中在純種制曲、雙菌種制曲[4]、后發酵工藝探究及低鹽豆豉的研究等方面。李響等[4]利用毛霉和枯草芽孢桿菌發酵豆豉表明混菌發酵可有效提高大豆發酵制品的品質特性，證實使用細菌和霉菌混合發酵可有效改善大豆發酵食品的品質特性。李俊健等[5]通過多菌復合畢赤酵母發酵優化淡豆豉的發酵工藝條件，提高了淡豆豉溶栓酶活性，但缺乏對風味和基本成分的研究。眾所周知，植物乳桿菌能夠產生豐富的風味物質，能夠改善食品風味，如崔憲等[6]以植物乳桿菌發酵大豆分離蛋白，結果表明植物乳桿菌發酵有助于大豆分離蛋白的水解，因此，采用植物乳桿菌復合發酵淡豆豉有助于大豆蛋白的水解利用及風味物質的產生。文鶴等[7]對比了純種產香酵母Trichomonascus ciferrii發酵豆豉與自然發酵豆豉的揮發性成分，自然發酵中檢測出87 種揮發性成分，純種發酵中檢測出44 種成分，相較于純種發酵，自然發酵豆豉其風味更加的多元及穩定。由于不同地理氣候、溫度、濕度等自然條件原因，自然發酵難以精確控制，難以實現工業生產，混菌發酵模擬了自然發酵多菌株共同發酵的特點，有助于提升風味物質豐度及降低控制難度，是改善淡豆豉風味實現工業生產的重要途徑。然而，對于混菌發酵改善淡豆豉風味及相關產生機制的研究缺乏深入的探索，嚴重限制了淡豆豉的推廣應用。在本團隊前期的研究中，以中國根霉12 為發酵菌株發酵淡豆豉，并對比了黑龍江、云南、福建、內蒙古、河南五個地區黑豆根霉發酵淡豆豉的理化指標及風味指標，數據表明黑龍江黑豆根霉發酵所得的淡豆豉風味與品質明顯優于其他地區發酵淡豆豉。在最優工藝下得到的淡豆豉溶栓酶活力為17122 U/g[8]，但其發酵過程中營養成分和揮發性物質的變化還有待進一步研究。

鑒于此，本研究以黑龍江黑豆為原料，采用根霉發酵和混菌發酵兩種發酵方式，動態對比兩種發酵模式中淡豆豉基本成分、活性成分及風味的變化。為淡豆豉的發酵機理、發酵過程中風味成分和活性成分變化的規律及形成機制提供了參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑龍江黑豆 十月稻田農業科技有限公司；凝血酶1000 IU 美國Sigma 公司；纖維蛋白原及尿激酶1240 IU 中檢所；大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆素、黃豆黃素、染料木素等標準品 HPLC≥98%，上海源葉生物科技有限公司；中國根霉12、乳酸芽孢桿菌DU-106 與植物乳桿菌混合菌粉 保藏于華南農業大學食品學院新資源食品與功能性原料研究及評價中心；磷酸緩沖鹽溶液（PBS） 實驗室配制；5%磺基水楊酸溶液 廣州成碩生物科技有限公司。

GCMS-QP2010ULTRA 氣相色譜-質譜儀、LC-20AT 高效液相色譜儀 日本島津公司；雷磁PHS-3E pH 計 上海儀電公司；日立L-8900 型氨基酸分析儀 日立高新技術公司；FD-1 真空冷凍干燥機北京博醫康技術公司；Rapid N exceed 杜馬斯定氮儀上海艾力蒙塔貿易有限公司；PEN3 電子鼻 北京盈盛恒泰科技有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 淡豆豉發酵工藝

參考文獻[9]的方法并略作修改，發酵工藝（圖1）操作要點如下：5 倍體積三級水25 ℃避光浸泡12 h；20 ℃濕度90%避光發芽48 h；121 ℃滅菌15 min；冷卻至35 ℃以下接種；根霉發酵接種孢子數為2×107～5×107個/mL 根霉活化液2%（V/W），混菌發酵須添加107CFU/mL 乳酸菌活化液2%（V/W）和孢子數為2×107～5×107個/mL 根霉活化液2%（V/W），32 ℃避光發酵9 d[10]。

取樣方法：分別取發酵0、1、3、5、7、9 d 的淡豆豉凍干粉碎過80 目篩樣品進行分析。

1.2.2 淡豆豉基本成分測定 pH 測定：稱取5.00 g樣品粉末，加入25 mL 蒸餾水，振蕩20 min，使用pH 計直接測定。

菌落總數：參照GB 4789.2-2016[11]；總糖和還原糖：采用3,5-二硝基水楊酸（DNS）比色法測定總糖和還原糖[12]；總酸：參照GB 12456-2021[13]；蛋白質：采用杜馬斯燃燒法測定蛋白質[14]；脂肪：參照GB 5009.6-2016[15]；灰分：參照GB 5009.4-2016[16]；氨基酸態氮：參照GB 5009.235-2016[17]。

1.2.3 淡豆豉活性成分測定

1.2.3.1 溶栓酶測定 參考文獻[18]的方法測定淡豆豉溶栓酶活性。

PBS 溶液的配制：稱取NaCl 8 g，KCl 0.2 g，Na2HPO4·12H2O 3.63 g，KH2PO40.24 g，溶于900 mL蒸餾水中，用鹽酸調pH 至7.4，用蒸餾水定容至1 L，常溫保存。

取0.05 g 淡豆豉樣品溶于1.5 mL PBS 溶液，4 ℃靜置24 h，搖勻，10000 r/min 離心10 min，取上清液備用。將10 μL 樣品溶液打入纖維蛋白瓊脂糖平板的圓孔內，37 ℃培養18 h 后，分別測定纖維蛋白溶解圈的兩個垂直直徑，計算其乘積近似為纖維蛋白溶解圈的面積。將待測樣品的透明圈面積與標準曲線比較，計算樣品酶活大小。

1.2.3.2γ-氨基丁酸測定 采用比色法測定γ-氨基丁酸[19]。

標準溶液及曲線制備：準確稱量γ-氨基丁酸標品100 mg，一級水定容至100 mL，稀釋得到0.10、0.25、0.50、0.75、1.00 mg/mL 標準溶液，取標準溶液0.5 mL，加入0.5 mL 的硼酸鹽緩沖溶液（pH9.0，0.2 mol/L）、1 mL 6%的重蒸苯酚，搖勻，3 min 后加入1 mL NaClO溶液（活性氯為8%～12%），混勻后沸水浴10 min，取出立即冰浴20 min，持續震蕩直至出現藍綠色化合物，加入60%的乙醇溶液2.0 mL，再次震蕩均勻，靜置10 min 后于645 nm 處測定吸光度，以蒸餾水代替標準液做空白對照。

樣品γ-氨基丁酸提取及測定：準確稱量0.50 g豆豉粉末以蒸餾水定容至50 mL，60 ℃水浴震蕩2 h，4000 r/min 離心20 min，取上清經0.45 μm 微膜過濾，取0.5 mL 按標曲方法步驟測定，曲線公式為：Y=1.9633X+0.0231（R2=0.9992）。

1.2.3.3 大豆異黃酮測定 參考文獻[20]方法及其洗脫程序，采用高效液相色譜法測定大豆異黃酮，通過保留值定性分析大豆異黃酮，通過外標標準曲線法以峰面積為指標定量分析大豆異黃酮含量。色譜柱為Agela promosil C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫36 ℃；進樣量10 μL；流動相為0.1%（V/V）乙酸水溶液（A）和100%乙腈（B）；流速為1 mL/min；檢測波長260 nm（UV）。

1.2.4 淡豆豉風味成分測定

1.2.4.1 豆豉游離氨基酸含量測定 樣品前處理：0.1 g樣品用3 mL 5%磺基水楊酸溶液研磨，轉移到離心管，靜置1 h，12000 r/min 離心10 min，取上清液按1:3 比例和水稀釋，并通過0.22 μm 濾膜裝置將混合液過濾在進樣瓶中。

分析條件：色譜柱：日立855-4507 型（60 mm×4.6 mm，3 μm）；反應柱溫：135 ℃；檸檬酸（鋰）PBF緩沖液梯度洗脫；檢測波長：570 nm+440 nm；流速：洗脫泵0.35 mL/min，衍生泵0.30 mL/min；分析時間：148 min[21]。

1.2.4.2 HS-SPME/GC-MS 測定揮發性成分 HSSPME 方法萃取樣品揮發性成分：取樣品2 g 于50 mL 頂空瓶，以環己酮作為內標，密封，90 ℃平衡5 min，插入已經活化好的50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，頂空吸附30 min，插入GC 進樣口解析

3 min[22]。

色譜條件：DB-WAX 色譜柱（60 mm×0.32 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，流速1 mL/min，設置升溫程序條件為：進樣口溫度為250 ℃，色譜柱初始溫度為50 ℃保持2 min，接下來以3 ℃/min的速度上升至220 ℃，保持5 min，不分流進樣。

質譜條件：電離方式：EI，發射電流：80 μA，電子能量為：70 eV，掃描范圍為m/z 30～400，離子源溫度：230 ℃，接口溫度：240 ℃。

定量分析：根據被測化合物和內標物環己酮相應的色譜峰面積之比，計算被測組分的相對含量，表示為μg/kg，計算公式如下：

式中：Mc 為化合物相對含量（μg/kg）；ST：總離子流圖中化合物峰面積；C標：內標物質濃度（μg/mL）；S標：內標物質峰面積；V標：內標物加入的體積（μL）；m：樣品質量（kg）。

1.2.4.3 電子鼻測定氣味強度的變化 分別稱取不同發酵階段的淡豆豉樣品3.0 g，裝入密封塑料杯中，室溫平衡30 min 后，插入電子鼻的進樣針頭進行測定。測定條件：采樣時間1 s/組；傳感器自清洗時間120 s；傳感器歸零時間10 s；樣品準備時間5 s；進樣流量400 mL/min；分析采樣時間120 s[23]。采用電子鼻內置程序（Winmuster，version 1.6.2）進行數據處理與分析，傳感器靈敏物質分類見表1。

表1 傳感器靈敏物質分類Table 1 Sensor sensitive material classification

1.3 數據處理

數據結果采用SPSS 26、GraphPad Prism 8 和DPS 7.0 等統計分析軟件進行數據分析及顯著性分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 不同發酵方式發酵過程中pH 和菌落總數的變化

淡豆豉發酵是酸性發酵，pH 會直接影響豉曲中蛋白酶的活性及微生物的生長和代謝，酸性環境有利于酸性和中性蛋白酶等酶系的積累及淡豆豉后發酵過程中苦味脫除[24-25]。由圖1A 可知，根霉發酵pH 由發酵前的6.59 下降至發酵后的6.35，而混菌發酵pH 持續下降，從6.59 下降至5.96?？偹岷孔兓鐖D1B 所示，發酵自第3 d 開始，混菌發酵所產總酸含量大于根霉發酵，后雖有波動，但最終混菌發酵總酸含量仍高于根霉發酵，乳酸在發酵所產生的有機酸中酸性較強，故推測混菌發酵中后期乳酸菌大量繁殖產生了乳酸導致pH 持續下降。菌落總數變化如圖1C 所示，發酵第1 d，發酵微生物數量已達到較大基數，而隨發酵的進行，微生物總數總體呈上升趨勢，整個發酵過程中根霉和乳酸菌未出現較大的起伏，另外發酵過程中未檢測到其他雜菌，說明發酵過程穩定進行。

圖1 不同發酵方式對pH、總酸和菌落總數變化對比Fig.1 Comparison of different fermentation methods on pH,total acid and total number of bacteria

2.2 不同發酵方式發酵過程中基本成分變化

由表2 可知，兩種發酵方式發酵前和發酵后的基本成分都發生了變化，根霉和混菌發酵前后，總糖的含量都顯著降低（P＜0.05），還原糖、總酸、氨基酸態氮和灰分的含量顯著提高（P＜0.05）。根霉發酵蛋白質顯著降低（P＜0.05），混菌發酵蛋白質顯著升高（P＜0.05）；根霉發酵前后對脂肪含量變化影響不明顯，而混菌發酵卻顯著提高了脂肪的含量（9.10%）。產生這些變化的原因可能是發酵過程中根霉等微生物分泌淀粉酶將淡豆豉中的淀粉水解，超過微生物的消耗量，還原糖上升，總糖被水解為單糖被微生物利用，總體呈下降趨勢；由于根霉等微生物產生大量的蛋白酶，使得淡豆豉中蛋白質被分解成小分子多肽和氨基酸等可溶性含氮物，氨基態氮含量逐漸增加；前期總酸含量逐漸增加，可能是因為根霉生長代謝的次生產物有機酸或脂肪酸造成的[26]，混菌發酵脂肪含量提高的原因可能是乳酸芽孢桿菌分泌物對脂肪酸等物質的氧化具有一定的抑制作用[27]。

表2 不同發酵方式對淡豆豉基本成分的影響Table 2 Effects of different fermentation methods on basic components of SSP

2.3 不同發酵方式對淡豆豉活性物質的影響

大豆異黃酮廣泛存在于豆類食品中，是豆類重要的生物活性物質，如圖2A 所示，發酵過程中大豆異黃酮含量升高，且混菌發酵大豆異黃酮含量高于根霉發酵，根霉發酵大豆異黃酮含量由2.31 mg/g 增加至3.20 mg/g；而混菌發酵大豆異黃酮含量由2.25 mg/g 增加至3.91 mg/g，線性方程及相關系數見表3，兩種發酵模式大豆異黃酮含量均高于曹冬英等[28]報道的四種市售黑豆成品淡豆豉（異黃酮最高含量1.64 mg/g）中異黃酮的含量，但是低于趙佳琪等[29]以馬料豆為發酵原料所發酵的淡豆豉（4.37 mg/g）中的異黃酮的含量，可能是由于馬料豆中的異黃酮含量本身高于雄黑豆。γ-氨基丁酸是一種非蛋白質組成天然氨基酸，是哺乳動物中樞神經系統首要抑制性神經遞質，具有鎮靜、抗焦慮、增強記憶及改善睡眠的作用，對抑郁、失眠、自主神經失調等疾病有明顯改善作用[30]，如圖2B 所示，發酵能夠有效提高γ-氨基丁酸的含量，但混菌發酵γ-氨基丁酸的含量低于根霉發酵，混菌發酵γ-氨基丁酸最終含量為3.03 mg/g，較發酵前增加1.11 mg/g，根霉發酵γ-氨基丁酸最終含量為4.83 mg/g，較發酵前增加3.09 mg/g，這可能是由于低酸導致γ-氨基丁酸不穩定。豆豉溶栓酶具有良好的降血栓作用，是繼納豆激酶之后發現的一種具有強烈溶解血栓纖維蛋白功能的絲氨酸蛋白酶[3]，如圖2C 所示，在發酵過程中溶栓酶活性呈增長趨勢，且混菌發酵整體高于根霉發酵，發酵第9 d 活性達到最大值，其中混菌發酵淡豆豉溶栓酶活性為3927.84 IU/g，較發酵前增加3414.82 IU/g；根霉發酵淡豆豉溶栓酶活性為2152.20 IU/g，較發酵前增加1621.04 IU/g。結果表明，混菌發酵淡豆豉溶栓酶活性明顯高于根霉發酵淡豆豉。

圖2 不同發酵方式對淡豆豉活性成分的影響Fig.2 Effects of different fermentation methods on active components of SSP

表3 大豆異黃酮線性方程Table 3 Linear equation of soybean isoflavone

2.4 不同發酵方式對淡豆豉風味的影響

2.4.1 不同發酵方式對游離氨基酸的影響 為了更好比較混菌發酵和根霉發酵過程中氨基酸的呈味組成情況，參考索化夷等[31]的方法，將氨基酸分為鮮味（天門冬氨酸、谷氨酸）、甜味（蘇氨酸、絲氨酸、甘氨酸、丙氨酸）、苦味（纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、組氨酸、精氨酸、脯氨酸）和無味（賴氨酸）4 類。淡豆豉風味與蛋白質水解有一定關系，蛋白質水解形成強烈疏水的肽和大部分苦味氨基酸[32]，但同時也形成了鮮味氨基酸和甜味氨基酸，有助于弱化淡豆豉苦味，形成淡豆豉特殊風味。發酵過程中各類風味氨基酸的變化結果如圖3 所示，各類氨基酸隨著發酵進行，含量都有所增加，說明發酵過程中，蛋白質不斷降解成氨基酸，并形成不同的風味，但根霉發酵和混菌發酵前后對比，風味氨基酸的含量差距不明顯。

圖3 發酵過程中豆豉游離氨基酸分類匯總Fig.3 Classification and summary of free amino acids in SSP during fermentation

2.4.2 不同發酵方式對揮發性物質的影響 采用頂空-固相微萃取法和氣相色譜-質譜聯用技術（HSSPME-GC-MS）對兩種發酵過程中的揮發性風味物質進行分析[33-34]。兩種發酵方式的總離子圖如圖4所示，其中兩種發酵方式中揮發性成分種類大體相似。為了更好地統計揮發性物質的變化情況，對所有檢測出來的揮發性物質進行歸類處理，分為烷烴類、吡嗪類、醇類、酯類、酚類、烯烴類、醛類、酮類和其他類。如圖5 所示，在乳酸菌的作用下，混菌發酵淡豆豉的吡嗪類、醇類物質含量下降，醛類、酚類、烷烴類物質含量上升。根霉發酵和混菌發酵均檢測出7 種烷類成分，且種類相同，但混菌發酵中烷類成分的總量高于根霉發酵（圖5A）。淡豆豉烷烴類主要成分包括十二烷、正十四烷、正十六烷和壬基環己烷是其主要烷烴類成分，呈先增加后減少趨勢，十二烷具有乳酪味[35]。吡嗪是由蛋白質或氨基酸的熱分解和蛋白質或氨基酸與糖的美拉德反應產生的[36]，閾值較低，所以低濃度的吡嗪類化合物對樣品的風味影響較大。如圖5B 所示，根霉發酵和混菌發酵淡豆豉最終吡嗪含量分別為72.63 μg/kg 和55.46 μg/kg。添加乳酸菌發酵有利于減少淡豆豉發酵過程中的吡嗪類物質含量，吡嗪類物質閾值較低，天然發酵食品中低吡嗪含量多可呈優良風味，而高含量的吡嗪是納豆氨臭味和腐敗味的主要來源[37]。在混菌發酵中檢測到癸醚，其含量最高達4.13 μg/kg，醚類化合物中含有苯環的醚大多具有獨特芳香味[38]。其他風味成分在發酵過程中都呈現出波動變化的趨勢，總之，兩種發酵方式隨著發酵時間的進行，風味物質不斷得更新，最終發酵完成后呈現出淡豆豉獨有的發酵風味。

圖4 淡豆豉發酵過程中揮發性成分總離子圖Fig.4 Total ions of volatile components in SSP fermentation process

圖5 不同發酵方式發酵過程中揮發性物質變化Fig.5 Changes of volatile substances in different fermentation methods

2.4.3 電子鼻風味分析 采用德國PEN3 型電子鼻對根霉發酵和混菌發酵第0、1、3、5、7、9 d 的樣品進行分析，同一樣品各個傳感響應器取平均值分析后，繪制成雷達圖如圖6A 所示。從響應值變化程度判斷，淡豆豉樣品揮發性風味成分響應值主要集中在傳感器7 號、6 號、9 號、2 號、8 號（響應值＞2），其中7 號響應值最高，表明硫化物、甲基類化合物、芳香化合物、有機硫化物、氮氧化合物及醇類、酮類化合物對淡豆豉風味貢獻率較大[39]，這與揮發性物質烷烴類物質的含量最高結果相一致。其他相關揮發物類型含量較低，同時發現根霉發酵比混菌發酵淡豆豉樣品整體風味更濃，其中根霉發酵第5 d 淡豆豉響應值最大。

據圖6A 電子鼻數據進行PCA 主成分分析和k-mean 聚類分析結果發現，第一和第二主成分總貢獻率達到98.69%（第一主成分分析貢獻率為97.29%，第二主成分分析貢獻率為1.40%），說明第一主成分可反應樣品的大部分特征（圖6B）。從樣品特征聚類分析判斷，每種淡豆豉樣本數據離散程度較低，樣品檢測重現性較好。從樣品之間距離判斷，樣品可分為三類，根霉發酵第0 d 和第1 d 為一類，混合發酵第0 d 至第9 d 為一類，除第7 d 外其余天數重疊部分多，表明混菌發酵第7 d 風味物質與混菌發酵其余天數風味物質具有一定差異；根霉發酵第3、5、7、9 d為一類，且離散程度大，表明根霉發酵后淡豆豉風味差異較大。

圖6 淡豆豉風味雷達圖和聚類圖Fig.6 Radar map and cluster map of SSP flavor

3 結論

本研究探討不同的發酵方式對淡豆豉的品質和風味的影響，通過HS-SPME/GC-MS 和電子鼻等方法評價不同發酵模式的淡豆豉風味及品質的影響。結果表明兩種發酵模式淡豆豉之間的基本成分差別不大；混菌發酵相較于根霉發酵其溶栓酶活性提升82.50%，大豆異黃酮含量提升22.05%；混菌發酵降低了鮮味氨基酸和吡嗪等物質的含量，減少了腥味和腐敗風味，降低了W1W 傳感器檢測到的硫化物氣味濃度，改善了淡豆豉的不良風味。因此，將中國根霉12 和乳酸芽孢桿菌DU106 應用于淡豆豉的生產中，很大程度上改良了淡豆豉的風味，提高了淡豆豉的品質，為淡豆豉工業化應用提供理論指導。

目前混菌發酵菌株間的相互作用機制尚不清楚，所以監測不同菌種發酵過程中的成分變化，探究不同菌種在發酵過程中的相互作用，或者改良菌種等研究都是提升淡豆豉品質和風味的研究方向。