細胞因子在新生血管性年齡相關性黃斑變性中的作用研究進展

黨美佳，張小用，李 靜

(1.西安醫學院，陜西 西安 710021；2.陜西省人民醫院，陜西 西安 710068；3.西安醫學院第一附屬醫院，陜西 西安 710077)

年齡相關性黃斑變性(Age-related macular degeneration，AMD)是常見的視網膜變性疾病，可導致老年患者不可逆的中心視力喪失，是造成全世界老年人群發生不可逆性盲的主要原因。早期AMD臨床癥狀有玻璃體和視網膜色素上皮的異常。晚期AMD可以是非新生血管性(也稱為萎縮性、干性或非滲出性)或新生血管性(也稱為濕性或滲出性)[1-2]。新生血管性AMD(Neovascular age-related macular degeneration，nAMD)以黃斑區脈絡膜新生血管(CNV)、視網膜色素上皮脫離、黃斑區水腫和出血為主要特征[2]。晚期AMD可導致嚴重的永久性視力損害和失明，嚴重影響患者的生活質量和功能獨立性。nAMD發病機制錯綜復雜，目前認為與患者的年齡、遺傳、吸煙、氧化應激、免疫炎癥反應、視網膜色素上皮細胞(RPE)老化和代謝異常等多因素綜合作用有關[3]。細胞因子是一類在細胞信號傳遞過程中具有生物學活性的重要小分子多肽或糖蛋白，主要包括白細胞介素(IL)、干擾素(IFN)、腫瘤壞死因子(TNF)、集落刺激因子(CSF)、生長因子(GF)和趨化因子(CK)等。大量研究表明nAMD患者眼內多種細胞因子升高，細胞因子作為免疫和炎癥反應的重要介質在nAMD發病機制中起重要作用?，F就這些細胞因子在nAMD中的作用研究進展進行綜述，以期為nAMD的治療提供更多的思路和選擇。

1 白細胞介素

IL由白細胞產生，又可作用于多種細胞，在激活與調節免疫細胞，介導T、B細胞活化、增殖與分化，參與造血、傳遞信息，以及炎癥反應中起重要作用。Sakurada等[3-4]研究發現，IL-1α和IL-15在nAMD中的濃度均顯著高于白內障，這一趨勢在缺血/再灌注損傷大鼠模型的血漿中也觀察到。已有研究證實了AMD的RPE細胞中PYD結構域包含蛋白3(NLRP3)炎癥小體的激活，IL-1α被認為啟動了視網膜中NLRP3炎癥小體的組裝，在RPE細胞中使用IL-1α啟動炎癥小體增加了RPE細胞對光氧化損傷介導的氧化應激造成的細胞死亡的敏感性，并將誘導細胞死亡的機制從凋亡改變為細胞焦亡。這一過程可能促進了AMD的RPE變性[5]。由于RPE細胞死亡是AMD進展的中心環節，IL-1α已被認為是控制無菌視網膜炎癥的治療靶點。

IL-18在AMD發病中的作用尚不清楚。Doyle等[6]證明IL-18前體誘導RPE細胞腫脹，導致細胞死亡。然而，將活性形式的IL-18注射到小鼠視網膜中并沒有對組織造成損害。這與他們最初的發現一致，單獨注射IL-18或聯合抗血管內皮生長因子(VEGF)治療減少了激光誘導的CNV小鼠模型中的新生血管，IL-18在血管生成和新生血管形成中的作用已得到證實[7]。這些研究結果表明IL-18對nAMD有保護作用。關于此觀點，不同的研究說法不一。Tarallo等[8]報道，AMD患者捐贈的眼睛中Disher酶的表達減少，由于Alu RNA的積累，這種酶的減少足以誘導RPE損傷，該小組證明了Alu誘導的RPE毒性依賴于NLRP3炎癥小體成分的表達，如半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1(Caspase-1)和人細胞凋亡相關斑點樣蛋白(PYCARD)。為了驗證IL-18的保護作用假說，這個小組給缺乏Caspases-1的小鼠注射了IL-18，發現仍然引起了類似于Alu RNA積累的RPE損傷。多項研究[9-10]發現NLRP3炎癥小體是AMD發生的中心。炎癥小體通過將兩種主要的促炎細胞因子IL-1β和IL-18從不活躍的前體細胞裂解成為成熟的細胞因子來控制它們的成熟?？刂蒲装Y小體的激活實際上是控制AMD中IL-18的水平，從系統上看它是nAMD疾病進展的一個關鍵介質。

Mimura等[1]研究表明，nAMD組房水中IL-6和IL-8平均水平大約是白內障組的2～4倍。Seddon等[11]研究證明IL-6升高可能作為nAMD進展的標志。IL-6和IL-8是巨噬細胞和其他細胞產生的趨化因子，主要參與炎癥反應調節，具有調節免疫應答、急性期應答、抗感染免疫等功能，特別是在固有免疫應答中發揮重要作用[12]。IL-6是引起內皮通透性增加的重要介質，可以通過內皮細胞形態的改變和肌動蛋白絲的重排來誘導血管內皮通透性的增加。研究[13-14]顯示IL-6對于脈絡膜血管生成既是必要的，也是充分的，它可通過IL-6R和巨噬細胞的經典激活刺激脈絡膜血管生成，然后刺激血管生成。然而，Klein等[15]發現血漿IL-6水平與nAMD進展間沒有顯著聯系。Sato等[16]研究則認為IL-6水平是nAMD進展的負性因素。

Mimura等[1]研究表明nAMD患者房水中IL-8濃度較健康對照組顯著升高。IL-8在多種視網膜疾病中發揮著重要的作用，對中性粒細胞、嗜酸性粒細胞和T細胞有強大的趨化和激活作用。此外，IL-8能夠促進黏附分子表達，在新生血管形成中有重要作用。研究發現，大部分IL-8都聚集在RPE的脈絡膜面，IL-8基因可能是參與AMD發展的重要基因。

2 干擾素

IFN是內源性細胞因子，表現出有效的免疫調節、抗病毒和抗增殖特性。IFN-α和IFN-γ有促炎作用，而IFN-β主要作用是免疫調節。Afarid等[17]研究發現，nAMD患者血清IFN-β水平高于干性AMD。IFN受體激活可以誘導典型的JAK-STAT或替代信號通路，它們的協同作用導致多效性細胞反應，從而產生不同的生物反應。替代補體途徑、免疫細胞激活和自身免疫都是現已證實的nAMD重要的相關發病機制。有強有力的證據表明，IFN-β對小膠質細胞有免疫調節作用，可對抗中樞神經系統的自身免疫[18]。在nAMD的發展過程中，人補體因子H(CFH)在RPE細胞中過度表達可趨化單核細胞并誘導RPE細胞的趨化性遷移，是重要的免疫相關因素。IFN可顯著上調RPE細胞中CFH的表達，IFN-β給藥在nAMD的激光模型中發揮了積極的治療效果，有效地減弱了小膠質細胞和巨噬細胞的反應以及CNV的形成。Mo等[19]研究表明，IFN-γ可以過度表達IFN-γ誘導蛋白10(IP10)作為AMD的生物標志物。

如今，血管內皮生長因子(VEGF)被認為是導致CNV進展的因素。Sun等[20]研究表明，某些類型的IFN可以抑制VEGF的產生，視網膜中缺乏IFN信號可加速單核吞噬細胞反應并促進CNV。因此，IFN-γ可能對nAMD的進展產生重要影響。

3 腫瘤壞死因子

TNF是一種多效性促炎細胞因子，主要由單核細胞、巨噬細胞和淋巴細胞分泌。已觀察到可溶性腫瘤壞死因子受體Ⅱ(sTNFRⅡ)和TNF-α間存在很強的相關性，血漿中sTNFRⅡ水平隨著TNF-α水平的升高而升高。目前尚不清楚sTNFRⅡ是通過充當誘餌受體來抑制TNF-α功能，還是通過穩定血漿中不穩定細胞因子來促進TNF-α功能，從而導致持續的全身活動。IFN和TNF在體外誘導趨化因子、補體和VEGF上調。研究[21]表明TNF-α改變了RPE的VEGF分泌，TNF-α降低高極化RPE細胞中的VEGF分泌，但增加與c-Jun氨基末端激酶(JNK)和核因子-κB (NF-κB)通路間的串擾相關的非極化RPE細胞中的VEGF分泌。這表明，在健康RPE中TNF刺激可防止CNV，但在受損RPE中TNF刺激可增強VEGF誘導的滲出過程。與此一致的是，CNV的存在與循環單核細胞中TNF-α含量較高有關。在CNV動物模型和nAMD人體組織中觀察到巨噬細胞活化和M1表型極化，這也與高水平的TNF-α有關。鑒于早期nAMD中sTNFRⅡ的增加反映了TNF-α分泌的增加，這也與Faber C等的研究結果一致。nAMD患者血漿中sTNFRⅡ水平的升高是RPE和外周免疫細胞相互作用的結果，T淋巴細胞可以代表這種免疫細胞，因為已知這些細胞與RPE相互作用并分泌TNF-α。

4 集落刺激因子

促紅細胞生成素(EPO)是一種糖蛋白激素，傳統上認為它只在體內產生紅細胞。然而，隨著視網膜層中EPO和EPO受體(EPOR)的發現，EPO似乎在眼睛中也具有生理作用。有研究[22]觀察到EPO通過一種獨立機制與VEGF一樣有效地刺激血管生成，無論VEGF的誘導如何。在眼部，高水平的VEGF可由缺血、缺氧或高血糖引起，導致血管滲漏和新生血管形成，這在眼部疾病(如糖尿病視網膜病變和AMD)中非常明顯。因此，在DR和AMD患者中，以VEGF為靶點管理視網膜新生血管一直是減少糖尿病黃斑水腫和脈絡膜新生血管的策略。然而研究[22]表明，VEGF本身并不能完成血管生成，因此尋找其他同樣有助于血管生成的因子已經揭示了EPO的參與。在缺氧條件下，缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)的激活可引起血管生成，并促進VEGF轉錄的表達。同時，EPO的調節也由HIF-1α的控制介導[23]。因此，EPO與EPOR的結合可能具有誘導新生血管形成的潛力。也有研究證實EPO通過抑制Caspase來保護視網膜細胞免受光、缺氧、高氧和過氧化氫誘導的細胞凋亡，并通過VEGF和血管緊張素途徑上調血管生成反應。視網膜中EPO的表達以及隨后的絲/蘇/酪氨酸激酶磷酸化可能與氧化應激反應密切相關，從而實現分子水平上對細胞凋亡和血管生成的雙重作用[22]。

Schwarzer等[24]研究發現，集落刺激因子-1受體(CSF-1R)抑制劑PLX5622對CSF-1R的抑制導致CNV的更快消退。另外，研究顯示CSF-1誘導人單核細胞產生VEGF和血管生成活性，抑制CSF-1R可降低VEGF水平。因此，阻斷受體可能影響由表達CSF-1R的細胞介導的血管生成。

5 生長因子

有研究發現AMD患者眼房水VEGF、VEGF受體(sVEGFR-1和sVEGFR-2)水平顯著高于白內障對照眼。在nAMD患者中，新生血管從脈絡膜生長到視網膜下區域。這些與CNV相關的異常血管具有多孔壁，與視網膜下出血或液體滲漏相關。VEGF已被確定為AMD中CNV發展的關鍵分子，這一點在兔CNV形成中也已被證實[1，25]。在培養的人視網膜內皮細胞中，VEGFR-1和VEGFR-2的激活通過降低閉合蛋白水平導致緊密連接中斷，因此VEGF受體信號通路在血-視網膜屏障功能障礙的發展中起著關鍵作用。在培養的牛視網膜內皮細胞中，VEGF誘導sVEGFR-2磷酸化和下游信號級聯的激活，包括蛋白激酶C-細胞外信號調節激酶1/2。此外，抑制VEGF-VEGFR-2信號傳導可阻止視網膜內皮細胞間緊密連接蛋白[包括閉鎖小帶-1(ZO-1)、ZO-2和閉合蛋白]的丟失，并防止血-視網膜屏障被破壞。在動物模型中，局部或全身使用低分子量VEGFR-2/Src激酶抑制劑可防止VEGF誘導的血管通透性增加，阻斷血管生成，并減少視網膜水腫。

轉化生長因子(TGF)家族成員具有多效性，在調節血管內皮細胞和平滑肌細胞方面可能具有不同的作用，它們的促血管生成和抗血管生成作用依賴于環境。Tosi等[26]研究發現，nAMD患者房水中TGF-β1濃度明顯高于白內障對照組，表明TGF-β1參與nAMD的形成。已證明生理條件下TGF-β2在房水中表達，通過對量化激活的TGF-β2和TGF-β2的總蛋白濃度進行研究，證實了Bai等的研究數據[27]。他們記錄到nAMD患者玻璃體TGF濃度增加，在人類手術切除的CNV組織中也記錄到TGF-β表達增加[28]。它不僅通過RPE誘導VEGF-α表達，而且其直接和間接抑制作用也與抑制上皮間質轉化、RPE細胞衰老以及阻斷CNV有關[29]。然而，研究[30]表明TGF-β在眼中可作為抗血管生成因子并保護RPE細胞和視網膜血管系統。

6 趨化因子

趨化因子由組織細胞和白細胞產生，結合到與其連接的G蛋白偶聯受體上可引起細胞反應，如遷移、黏附或趨化。趨化因子根據其氨基端(N端)半胱氨酸的排列方式，可分為CXC、CC、XC和CX3C四個亞族。研究表明趨化因子信號在年齡相關視網膜疾病中起作用。利用小鼠激光誘導的CNV模型對RPE細胞中趨化因子表達進行研究，微陣列分析顯示CXCR3表達增加，表明某些趨化因子/趨化因子受體與CNV有關[31]。

單核細胞是趨化因子的代表，炎癥發生時單核細胞被募集到血管炎癥部位，這些細胞可能有助于血管生成和傷口愈合。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1/CCL2)是一種有效的趨化因子，在健康視網膜中表達較少。然而，在血管生成的早期階段,損傷模型如激光誘導了依賴于CCL2/CCR2途徑的單核細胞/巨噬細胞的遷移和浸潤，從而導致光受體的MORT(一種死亡域蛋白，促進Fas蛋白所在細胞的凋亡發生)激活，促進CNV的進展。研究[1]發現nAMD患者房水中和血清中的MCP-1濃度明顯高于對照組。此外，nAMD患者的眼內MCP-1濃度與黃斑厚度和黃斑水腫嚴重程度顯著相關。這些結果表明，MCP-1直接負責CNV和AMD周圍的成膜。利用人類細胞進行的體外研究[32]表明，MCP-1由視網膜微血管內皮細胞和RPE細胞組成性表達，其分泌被其他促炎分子增強。從小鼠RPE細胞釋放的MCP-1在體外激活小鼠眼巨噬細胞，并可消化RPE和基底膜中的纖維連接蛋白。

7 結 語

目前的研究表明，多種細胞因子在眼內表達增加，這些細胞因子可能影響nAMD各個階段的進程。在nAMD的進展中，這些細胞因子的作用可能是可變的，而且有時是相反的。需要進一步的研究來了解細胞因子在nAMD發病機制中的作用，以及它們如何與nAMD中其他重要因素相互作用，如氧化損傷、補體激活、細胞死亡和血管生成。以這些細胞因子及受體為靶點可能成為發現新的疾病途徑和治療方法的關鍵。