白藜蘆醇苷的抗氧化性及氧化產物分析

陳晨，孫繼鵬，趙錚，田瑞紅，鄧嘉進，姚云平*，李昌模，*

（1.天津科技大學食品科學與工程學院，天津 300457；2.桂發祥十八街麻花食品（天津）有限公司，天津 300221）

白藜蘆醇苷是從蓼科植物虎杖的干燥根莖中提取到的一種含有二苯乙烯結構的多酚類化合物[1]，又被稱為虎杖苷，分子式為C20H22O8，廣泛存在于虎杖、葡萄、花生、桑果等天然植物中[2]。研究表明，白藜蘆醇苷作為白藜蘆醇的一種糖苷衍生物，具有與白藜蘆醇類似的生理活性[3]，具有抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、抗心血管疾病[6]等多種對人體健康有益的生物學功能。

目前食品行業有關白藜蘆醇苷的研究主要集中在不同原料中的提取工藝、含量及其在貯藏期間的穩定性等方面[7]。研究表明，花生油和葡萄籽油中含有微量的白藜蘆醇苷[8]。然而迄今為止關于白藜蘆醇苷在油脂中的高溫氧化產物的研究鮮見報道[9-10]。

提高油脂的抗氧化性能一直是食用油行業的研究熱點，白藜蘆醇苷具有多種對人體健康有益的生物學功能，尤其是其具有的強抗氧化能力在食品工業生產領域中能夠發揮出巨大的潛能，所以將白藜蘆醇苷作為一種天然抗氧化劑加入到食用油脂中，發揮其抗氧化作用，在功能性油脂的開發利用中具有廣泛應用前景。因此，本文研究白藜蘆醇苷在油脂中的穩定性及其氧化產物的分離鑒定，對指導植物油適度加工并保留有益因子具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白藜蘆醇苷（純度≥95%）：天津所羅門生物科技有限公司；大豆油：嘉里糧油（中國）有限公司；Trolox（純度≥98%）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）（純度≥96%）、三吡啶基三嗪（tri pyridyl triazine，TPTZ）（純度≥98%）：上海源葉生物科技有限公司；三氯化鐵（分析純）：天津市北方天醫化學試劑廠；熒光素鈉（分析純）：上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純）：天津市康科德科技有限公司；鹽酸（分析純）、乙酸（色譜純）：天津市風船科技有限公司；乙酸鈉（純度＞99%）、無水乙醇（色譜純）：國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

高效液相色譜-串聯質譜（LC-20A）：日本島津公司；紫外可見分光光度計（TENSOR 27）、Multiskan酶標儀（ELX-808IU）：美國Thermo公司；旋轉蒸發儀（RE-2000A）：上海亞榮生化儀器廠。

1.3 抗氧化能力分析

1.3.1 DPPH自由基清除率的測定

精確稱量2.366mg DPPH溶解在甲醇中，制備為濃度60 μmol/L的溶液[11]。將500 μL稀釋樣品或Trolox標準液（20、40、100、200、300 μmol/L）與 300 μL DPPH溶液混合，在25℃下避光0.5 h，于517 nm處測定吸光度，白藜蘆醇苷標準品對DPPH自由基的清除能力用水溶性維生素E（Trolox）的當量（μmol/L TE）表示。根據測得清除率的大小計算白藜蘆醇苷的抗氧化性。

式中：A為樣品吸光度；A0為甲醇溶液的吸光度。

1.3.2 鐵離子還原能力測定

將鹽酸溶液（40 mmol/L）和TPTZ試劑混合制備為濃度10 mmol/L的TPTZ儲備液[12]。在37℃下將25 mL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH3.6）、2.5 mL TPTZ溶液和2.5 mL FeCl3（20 mmol/L）溶液混合以制備鐵離子還原能力（ferric reducing ability of plasma，FRAP）工作液。取工作液和樣品濾液在593 nm下測定其吸光度，計算公式如下。

式中：A為樣品吸光度；A0為工作液的吸光度；C為 Fe2+標準濃度，μmol/L。

1.3.3 氧自由基清除能力測定

向96孔黑色酶標板分別加入Trolox（濃度梯度）和白藜蘆醇苷標準品溶液25 μL，用多通道移液槍加入 150 μL 熒光素鈉（60 μmol/L），于 37℃下中速振搖2 min后保持20 min，設定激發波長為485 nm，發射波長為538nm條件下連續測定熒光強度。測定時需保持體系溫度為37℃，每2 min測定1次熒光強度，每次測定前中速振搖10 s，待熒光強度衰減至基線后停止測定[13]。

1.3.4 樣品的前處理

精確稱量一定量的白藜蘆醇苷標準品于10 mL離心管中，向其中加入微量的無水乙醇振蕩30 s使其充分溶解，將溶解后的混合溶液分別加入稱量好的大豆油中混合渦旋5 min后超聲20 min，使白藜蘆醇苷完全分散在油中。超聲結束后，取5 mL下清液置于旋轉蒸發器除去殘留乙醇水溶液，獲得含10、25、50、100、200 μg/g白藜蘆醇苷的油樣。將含有不同濃度白藜蘆醇苷的50 g大豆油置于9 mm培養皿中，將樣品分別在60℃烘箱中加速氧化0～5 d、在180℃烘箱中高溫氧化 0～8 h。

1.3.5 過氧化值的測定

參考GB 5009.227—2016《食品安全國家標準食品中過氧化值的測定》對加熱過程中的大豆油樣品進行過氧化值含量的測定，結果以meq/kg計[14]。

1.3.6 酸值的測定

參考GB 5009.229—2016《食品安全國家標準食品中酸價的測定》對加熱過程中的大豆油樣品進行酸值的測定，結果以mg/g計[15]。

1.3.7 氧化產物鑒定

1.3.7.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫Zorbax Eclipse Plus-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A為超純水、B 為甲醇；流速：1 mL/min；柱溫：35℃；進樣量：10 μL。梯度洗脫程序為0～5 min 時 40%A、60%B；5 min～11 min 時變為 40%A；11 min～15 min 時 10%A、90%B；15 min～16 min 時100%B；16 min～25 min 時保持到 65%A[16]。

1.3.7.2 質譜條件

電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）作為離子源，以正負兩種模式進行掃描，質譜掃描范圍在m/z 90～1000，檢測器電壓和界面電壓分別為1.57kV和4.5kV，加熱塊溫度為200℃[17]。氮氣以1.5 L/min的流速用作霧化氣體，流動相為甲醇和水，流速為0.2 mL/min。

1.4 數據處理

所有試驗均進行3次平行。使用Origin 9.0、Chemdraw軟件對數據進行處理并作圖，誤差線表示平均值的相對誤差。

2 結果與分析

2.1 白藜蘆醇苷的抗氧化能力

白藜蘆醇苷的抗氧化能力見圖1。

圖1 白藜蘆醇苷的抗氧化能力Fig.1 Antioxidant capacity of resveratrol glycosides

由圖 1 可知，在 40 μmol/L～200 μmol/L 的濃度范圍內，白藜蘆醇苷對DPPH自由基清除能力從21.58 μmol TE/L增加到81.83 μmol TE/L、鐵離子還原能力從22.77 μmol TE/L 增加到 160.61 μmol TE/L、清除含氧自由基的能力從43.11 μmol TE/L增加到184.47 μmol TE/L，這主要是由于羥基基團的數目是影響白藜蘆醇苷抗氧化性的關鍵因素，白藜蘆醇苷結構中的酚羥基能夠提供電子和/或氫供體來中和DPPH自由基以及活性氧，阻止自由基的進一步鏈式反應[18-19]，在鏈引發階段，變價金屬離子會誘發自動氧化反應，而白藜蘆醇苷中還原金屬離子的能力可以抑制引發劑中變價金屬離子的變價反應，從而起到抗氧化作用。

2.2 過氧化值的測定結果

添加不同濃度白藜蘆醇苷的大豆油樣品在60、180℃加熱過程中的過氧化值如圖2所示。

圖2 添加白藜蘆醇苷的大豆油過氧化值變化Fig.2 Changes of peroxidation value of soybean oil adding resveratrol glycosides

由圖2可知，當加熱條件為60℃時，加熱前3 d，各濃度的樣品過氧化值均低于對照組樣品，加熱進行到4 d時，添加量為100 μg/g和200 μg/g的樣品過氧化值急劇增長并且數值大于對照組，濃度為50 μg/g的樣品過氧化值最低。當加熱溫度為180℃時，在氧化初期（加熱時間0～4 h）樣品的過氧化值與對照組相比差異不大，氧化至8 h時，添加量為200 μg/g濃度的樣品過氧化值高于對照組，說明此時高濃度白藜蘆醇苷已經開始失去抗氧化作用。在整個加熱氧化的8 h內，當白藜蘆醇苷添加量為50 μg/g時，過氧化值始終低于對照組并且一直處于最低值，該結果與在60℃條件下得到的結果一致。

2.3 酸值的測定結果

添加不同濃度白藜蘆醇苷的大豆油樣品在60、180℃加熱過程中的酸值見圖3。

圖3 添加白藜蘆醇苷的大豆油酸值變化Fig.3 Changes of soybean oil acid value with addition of resveratrol glycosides

由圖3可知，兩種加熱條件下，隨著加熱時間的延長，不同樣品組的酸值變化和過氧化值的變化趨勢一致，在60℃加熱0～5 d和在180℃加熱0～6 h，濃度為50 μg/g的樣品過氧化值和酸值始終低于對照組，說明白藜蘆醇苷的添加延緩了大豆油的氧化進程，該結果表明在大豆油中添加50 μg/g的白藜蘆醇苷可以有效抑制過氧化物以及不飽和脂肪酸的生成。然而在180℃加熱6 h～8 h內，濃度為50 μg/g的樣品過氧化值低于對照組，而酸值卻高于對照組，這表明該添加白藜蘆醇苷的油脂樣品在高溫條件下長時間加熱后體系內不飽和脂肪酸的雙鍵被打開，逐漸形成大量的初級過氧化物，且這些初級過氧化物開始進一步氧化為醛、酮、酸類二次氧化產物，導致此時分解出的游離脂肪酸的含量增加，表明此時油脂開始發生更高程度的氧化。

2.4 白藜蘆醇苷的熱降解速率

由于在過氧化物生成量和酸值變化中，白藜蘆醇苷濃度為50 μg/g的樣品較對照組相比表現出最佳的抗過氧化氫生成能力。為進一步了解白藜蘆醇苷在氧化過程中的變化情況，因此探究此添加濃度在加速氧化過程中白藜蘆醇苷的熱降解率，結果如圖4所示。

圖4 白藜蘆醇苷降解率示意圖Fig.4 Degradation rate diagram of resveratrol glycosides

由圖4可知，隨著加熱時間的延長，白藜蘆醇苷的濃度逐漸降低。在60℃加熱條件下加熱0～5 d，白藜蘆醇苷的濃度由50.00 μg/g降解為7.72 μg/g。加熱0～2 d內，白藜蘆醇苷的濃度急劇下降為10.40 μg/g，降解率為79.2%。加熱至5d時，白藜蘆醇苷的降解率達到85%。在2 d～5 d內白藜蘆醇苷的損失量變化較小，同時在該加熱階段內的大豆油過氧化值和酸值增長也較為平緩，表明在此時間段內大豆油氧化程度趨于穩定。在180℃加熱條件下，降解1 h后白藜蘆醇苷的降解率為73.68%，加熱1 h～8 h階段，白藜蘆醇苷的降解率由73.68%逐步增加到83.78%，含量變化逐漸減小。

2.5 白藜蘆醇苷的氧化產物鑒定

為了進一步了解白藜蘆醇苷在高溫加熱條件下生成的氧化產物，采用高效液相色譜串聯質譜對添加50 μg/g白藜蘆醇苷的大豆油樣品在60、180℃加熱過程中生成的熱氧化產物進行檢測和鑒定，結果如圖5所示。

由圖5可知，在二極管陣列檢測過程中，添加白藜蘆醇苷的樣品經60℃加熱后除了出現目標物，還出現了5個額外峰，經180℃加熱的樣品與對照組相比生成6個峰，表明白藜蘆醇苷在氧化時生成了新的氧化產物。

圖5 白藜蘆醇苷在兩種加熱條件下的色譜Fig.5 Chromatographic of resveratrol glycosides under two heating conditions

以ESI為離子源，在負離子掃描模式下，白藜蘆醇苷的全掃描一級質譜以準分子離子峰m/z 389[M-H]－為基峰[20]。白藜蘆醇苷氧化產物的裂解途徑見圖6。

圖6 白藜蘆醇苷氧化產物裂解途徑示意圖Fig.6 Diagram of the cleavage pathway of resveratrol glycosides oxidation products

由圖5、圖6可知，1號峰（m/z 138.03）的產物結構來自白藜蘆醇苷二苯乙烯結構中連接兩個苯環的雙鍵發生氧化斷裂，導致3，5-二羥基苯甲醛作為氧化產物生成。2號峰（m/z 227.08）的產物為白藜蘆醇苷糖苷鍵斷裂所生成的白藜蘆醇。3號峰（m/z 436.13）是由兩分子的2號產物在負離子模式下結合生成[2M-H]-的二聚體分解生成的碎片離子[21]。5號峰（m/z 306.09）的產物離子是由m/z 435二聚體結構中的四氫呋喃環發生CO醚鍵斷裂以及C-C鍵斷裂生成的產物離子。4號峰（m/z 244.07）的氧化產物對應于白藜蘆醇的[M+O-1]-的分子離子峰。加熱過程中二苯乙烯結構上2'、3'位和4'、5'位之間兩個化學鍵發生鍵斷裂導致失去1分子C2H2O（42 Da）后，在斷鍵位置處形成缺電子活性中心，從而促使間苯二酚的苯環開環形成m/z 185.10（7號峰）的產物離子。在此基礎上，4'-OH所連接的碳原子上的一個烴基帶著電子對發生遷移，羥基氧原子上未共用電子轉移到碳氧之間形成雙鍵，經環化作用后形成6號峰（m/z 171.04）的產物離子。

3 結論

本文研究不同濃度的白藜蘆醇苷添加在大豆油后，其添加濃度與油脂理化指標的量效關系，結果表明：添加50 μg/g白藜蘆醇苷對大豆油的熱穩定性起到最好的抗氧化效果?；诖私Y果模擬60℃烘箱加速氧化以及180℃高溫油炸兩種條件對白藜蘆醇苷氧化穩定性的影響，并采用高效液相色譜串聯質譜法監測在氧化過程中白藜蘆醇苷及其氧化熱降解產物的變化，監測到質荷比分別為 138.03、171.04、185.10、227.08、436.13、244.07、306.09的7種氧化產物并推測其裂解機制，為進一步了解白藜蘆醇苷的裂解機理和氧化產物生成途徑提供了依據，該結果為白藜蘆醇苷在食用油抗氧化領域的開發應用提供了參考。