不同產前診斷指征孕婦胎兒染色體異常檢測及隨訪結果分析

陳惠娟 劉小燕 劉 霖 肖媛媛 胡芷晴 張 浩 徐志紅

四川省德陽市人民醫院(618000)

染色體異?？梢鸹虻娜笔?、重復、重排，導致自發流產、胚胎畸形、出生缺陷[1]。染色體異常疾病目前尚無有效治療方法，對高危孕婦產前診斷，對胎兒染色體異常者進行合理干預，是減少降低出生缺陷有效方法[2]。本文分析羊水細胞異常染色體核型的分布及不同產前診斷指征胎兒染色體異常檢出情況，為臨床有效干預提供參考。

1 對象與方法

1.1 對象

回顧性收集2018年1月-2020年6月來本院遺傳咨詢門診就診并行羊膜腔穿刺術產前診斷的3245例孕婦臨床資料。產前診斷指征包括唐氏篩查高/臨界風險、高齡、胎兒頸部透明帶厚度(NT)值異常、B超發現多發畸形、不良妊娠史、無創產前DNA篩查(NIPT)染色體異常高風險、夫妻一方染色體異常、孕期用藥及致畸因子接觸史、夫妻一方先天異常、家族單基因疾病攜帶、要求診斷。年齡18～49歲，孕16～32周。所有孕婦術前簽署知情同意書。本研究經院倫理委員會審批。

1.2 染色體檢測方法

B超引導下行羊膜腔穿刺術，抽取羊水20ml分別裝于2管15ml無菌離心管中，轉移至產前診斷實驗室離心。在超凈工作臺內嚴格無菌操作棄上清液，留取0.5ml制備為細胞懸液，分別接種于裝有3.5ml羊水培養基的培養瓶中。置5%CO2培養箱中，37℃培養7天。將細胞置于倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況并換液。隨后繼續觀察細胞生長，如培養瓶底可觀察到較多較大克隆的貼壁細胞，并有較多圓而亮的細胞，便可收獲細胞。將培養后的羊水細胞常規制片、G顯帶。顯微鏡下計數20個分裂相，選擇5個分散較好帶紋清晰的5個細胞分裂相進行核型分析，觀察到異常核型加大中期分裂相計數和羊水細胞染色體的核型分析。羊水細胞染色體核型描述和命名依據人類細胞遺傳學國際命名體制。選擇同時進行基于二代測序技術的染色體拷貝數變異檢測(CNV-seq)孕婦，B超引導下行羊膜腔穿刺術時，另取5ml羊水于離心管中，無菌轉移至產前診斷實驗室離心棄上清，根據TIANamp基因組DNA提取試劑盒(天根)說明書提取羊水細胞基因組DNA。根據NextSeq 550AR(安諾優達)試劑盒說明書進行文庫構建、質量控制、測序。測序結果根據ACMG指南進行CNV評級。

1.3 統計學分析

應用SPSS 23.0統計學分析。使用(%)表示計數資料，χ2檢驗。P<0.05具有統計學意義。

2 結果

2.1 羊水細胞染色體異常核型分布

本研究分析的3245例羊水細胞樣本，培養成功3244例，成功率99.97%；發現異常核型151例，異常檢出率4.56%。異常核型分布見表1。

表1 151例羊水細胞染色體異常核型檢出情況

2.2 染色體異常核型在不同產前診斷指征中檢出情況

3244例羊水標本中染色體異常核型檢出151例。不同產前診斷指征者異常檢出率不同，其中NIPT染色體異常高風險檢出率最高，其次為夫妻一方染色體異常，再次為NT值異常。在不同產前指征中以血清學唐氏篩查高/臨界風險、高齡妊娠、B超多發畸形3個指征為主。各產前指征染色體異常檢出率具有差異(P<0.05)，檢出情況見表2。其中因夫妻雙方攜帶同型地中海貧血基因行產前診斷的23例孕婦，19例為夫妻雙方攜帶α地中海貧血基因，4例夫妻雙方攜帶β地中海貧血基因。經產前診斷3例為α地中海貧血基因純合突變，1例為β地中?；蚣兒贤蛔?，并終止妊娠。見表3。

表2 羊水染色體核型高危因素與異常核型分析[例(%)]

表3 不同產前診斷指證者核型正常胎兒妊娠結局[例(%)]

2.3 產前篩查NIPT與血清學檢測效率

本文NIPT染色體高風險孕婦55例，經產前診斷分析后發現NIPT對T21具有較高的準確率，對T18、T13準確率較差，對性染色體數目異常準確率最低。見表4。

表4 NIPT染色體異常與羊水診斷結果[例(%)]

2.4 CNV-seq 在不同產前診斷指征中檢出情況

1089例行CNV-seq檢測，染色體非整倍體檢出37例，嵌合體檢出5例，致病性CNV異常檢出16例。B超檢查異常及NIPT染色體異常高風險指征者染色體拷貝數變異(CNV)異常檢測率最高。見表5。

表5 不同產前診斷指證者CNV-seq檢測結果[例(%)]

2.5 妊娠結局

3244例中有2948例明確妊娠結局，隨訪率90.9%(2948/3244)，151例羊水細胞染色體異常核型中2例無明確妊娠結局。終止妊娠65例，活產83例。3093例羊水細胞染色體核型正常中有明確妊娠結局2799例，活產2778例，活產率為99.3%。21例因B超發現異常終止妊娠，14例經CNV-seq檢測找到遺傳學病因。見表3、表6。

表6 核型異常胎兒妊娠結局[例(%)]

3 討論

3.1 產前診斷是檢出染色體異常有效方法

染色體數目異常與結構異?？梢鹑旧w疾病，有效檢出染色體異常核型方法至關重要。多種篩查和診斷方法聯合應用可相互補充提高診斷效率。對高危因素指征孕婦進行產前診斷，能有效檢出異常染色體避免出生缺陷發生。本文分析回顧了3245例羊水標本檢測結果，培養失敗1例，成功核型分析3244例，包括染色體多態共檢出異常核型151例，異常檢出率為4.65%。常染色體數目異常主要以21三體核型為主，包括27例標準型、2例嵌合型，該疾病是最常見的染色體疾病，是產前診斷重要的目標疾病。其次為18三體核型，4例標準型、2例嵌合型，其發生率僅次于21三體綜合征，是圍產嬰兒死亡的重要疾病之一。性染色體數目異常主要以克氏綜合征最為多見，其次為特納綜合征嵌合體?？耸暇C合征在新生兒男嬰中的發病率為1/660[3]。

3.2 NIPT高危指征中染色體異常檢出率最高

無創產前檢測是產前篩查的一種方法，檢測基于孕期母體外周血胎兒游離DNA與母體游離DNA共同檢測以判斷胎兒非整倍體異常。相對于傳統血清學產前篩查，具有更高的檢出率、更低的假陽性率及假陰性率，因此越來越被臨床醫生及孕婦所接受[4]。本文中55例孕婦因NIPT檢測為染色體異常高危人群行羊水染色體核型分析，其中21例NIPT提示有小于5Mb拷貝數變異，經CNV-seq檢測出19例拷貝數變異，與NIPT篩查結構相符；另外1例羊水核型分析和CNV-seq檢出缺失異常。NIPT對21三體綜合征篩查效率最高，而對于性染色體異常篩查效率表現較差。有研究觀察NIPT檢測胎兒性染色體異常準確性發現，其對性染色陽性預測值較低，對性染色體嵌合者檢出能力更為不理想[5]。

NIPT基本原理是基于母體外周血游離胎兒DNA來源于滋養層細胞，占游離DNA的15%～20%。因此當任何一方面出現異常都將導致不準確檢測結果，如假陽性及假陰性。導致假陽性的常見也是主要原因是限制性胎盤嵌合，胎盤限制性三體嵌合其凋亡細胞DNA釋放到母體循環系統導致假陽性結果。其次為母體存在自身嵌合現象、母體在目標染色體上存在拷貝數增加、母體罹患惡性腫瘤或雙胎之一停止發育的胎兒將異常染色體DNA釋放入母體循環均可導致假陽性結果。而導致假陰性結果的常見原因為母體循環中胎兒游離DNA濃度較低。當母體體重過大，母體循環血容量增加及大量脂肪細胞凋亡后其DNA釋放入血導致胎兒游離DNA相對稀釋；其次母體循環胎兒游離DNA含量隨孕周增加而增加，因此孕周過小，胎兒游離DNA含量低于4%時會導致NIPT技術檢測不出胎兒游離DNA而使結果出現假陰性；再次導致母體大量游離DNA釋放入血的疾病如血栓栓塞、系統性紅斑狼瘡、維生素B12缺乏等均會使胎兒游離DNA濃度相對降低導致假陰性結果。在罕見情況下胎兒嵌合體與胎盤染色體不一致時也是導致假陰性結果的另一原因[4]。鑒于此，相對于母血清產前篩查即使NIPT對21三體綜合、18三體綜合征、13三體綜合征具有更高的檢出率和準確性，也不能僅僅依據其陽性結果做出診斷，需要行侵入性產前診斷以明確診斷。

我國2015年“高通量基因測序產前篩查技術試行規范”規定NIPT技術的目標疾病仍是21三體綜合、18三體綜合征、13三體綜合征。盡管隨著技術的不斷發展對胎兒游離DNA性全基因組測序也能發現部分其他染色體非整倍體或結構異常，但一方面增加檢測成本，另一方其準確性需進一步循證醫學證實。因此NIPT技術不能完全滿足產前篩查目的。國際產前診斷協會推薦的一線產前篩查方案為妊娠早期(11～13周+6)超聲檢查并測量NT結合母體血清絨毛膜促性腺激素、妊娠相關糖蛋白A水平檢測，妊娠中期行胎兒結構超聲篩查。確定一線篩查方案某一風險孕婦人群使用NIPT檢測技術作為二線篩查的策略得到推薦[6]。同時妊娠中期結構超聲篩查在胎兒重大結構異常檢測中起重要作用。

3.3 NT在產前診斷中的價值

隨著檢測技術的不斷提高，超聲在檢測胎兒異常中應用越來越廣泛。其中NT這一胎兒結構成為妊娠早期胎兒染色體異常檢測的超聲指標。研究表明NT增厚不僅與胎兒染色體異常有關，同時還與遺傳性綜合征、結構異常、心臟發育異常等有關[7]。目前NT值作為妊娠早期胎兒非整倍體染色體異常的超聲指標具有高的靈敏性和特異性[8]。在本文分析中NT值異常指征的胎兒染色體異常檢出率為13.8%，僅次于NIPT高風險與夫婦一方染色體異常的指征，對篩查胎兒染色體異常有重要臨床意義。

3.4 夫婦一方染色體異常及高齡孕婦更應重視產前診斷

隨著我國人口政策調整，高齡孕婦增加，成為出生缺陷防控的重要對象。本文高齡孕婦染色體異常檢出率為4.3%。隨著母體年齡增長生成畸形配子的概率增加，易發生染色體不分離導致胎兒染色體“三體”疾病，如21三體綜合征、18三體綜合征、13三體綜合征[9]。因此我國法律規定，針對高齡孕婦直接通過羊膜腔穿刺術取得胎兒羊水細胞進行產前診斷，避免因目前母血清產前篩查技術的局限性引起的漏篩、漏檢、漏診情況。高齡孕婦更應重視產前診斷，預防染色體異?；純撼錾?。在產前診斷指征中夫婦雙方染色體異常者胎兒染色體異常檢出率為25%，僅次于NIPT高危組。父母染色體出現平衡性改變時，其遺傳物質劑量沒有改變而不出現臨床表型。但在生育過程中可能會形成不平衡性配子，胎兒將會出現嚴重臨床表現，甚至不能正常發育至分娩。因此夫婦雙方有染色體異常者是產前診斷高危指征之一，應當予以高度重視。

3.5 羊水細胞染色體核型分析可聯合分子遺傳檢測方法

染色體G顯帶核型分析是經典的遺傳學檢測技術，是診斷染色體疾病的金標準，廣泛應用于產前診斷及輔助生殖等領域[10]。但細胞培養生長情況、檢驗人員經驗、有限的分辨率等因素限制了其對染色體疾病，尤其是染色體小片段缺失/重復異常的檢出。本文2799例核型正常并有明確妊娠結局中，21例因后續發現B超異常終止妊娠，其中14例通過CNV-seq 檢測發現拷貝數變異，找到遺傳學病因。CNV-seq技術對CNV異常檢測效力是染色體核型分析所不能達到的，因此在產前診斷中僅僅應用單純的核型分析方法或僅使用一種檢測技術均不能滿足臨床需求。核型分析聯合CNV-seq檢測可提高對染色體異常檢出率[11]。但應注意平衡易位或倒位這類不涉及遺傳物質丟失的改變，CNV-seq技術不能有效檢出。目前各類檢測技術在產前診斷應用過程中，逐漸形成聯合應用模式，集各檢測技術之優勢相互補充其局限性。如核型分析聯合CNV-Seq、核型分析聯合染色體微陣列分析[12]，基于檢測STR的QF-PCR聯合CNV-seq、核型聯合產前BoBs以到達到快速檢測集9種核型不能檢出的常見微缺失/重復綜合征等等[13-14]。

NIPT高風險、母血清唐氏篩查高危是產前診斷指征。高齡、夫妻雙方染色體異常、B超異常等指征仍應予以重視。經典的核型分析聯合檢測拷貝數變異的CNV-seq可提高染色體異常檢出。針對各類產前診斷指征的染色體異常高風險孕婦行羊膜腔穿刺術，對胎兒染色體進行檢查，可有效檢出染色體異常胎兒，為遺傳咨詢及臨床干預提高依據。