警惕番茄褐色皺紋果病毒在我國的傳播和危害

石鈺杰,馬子玥,楊秀玲,周雪平

(中國農業科學院植物保護研究所,植物病蟲害生物學國家重點實驗室,北京 100193)

番茄作為世界各地廣泛種植的蔬菜作物,具有良好的營養價值和經濟效益。然而,番茄生長過程中經常遭受多種病毒病的危害,造成嚴重的產量損失和品質下降。據報道,目前至少有22科39屬的312種病毒、衛星病毒或類病毒能夠侵染番茄,主要包括菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus、煙草花葉病毒屬Tobamovirus、番茄斑萎病毒屬Tospovirus、黃瓜花葉病毒屬Cucumovirus和馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus病毒[1]。

番茄褐色皺紋果病毒(tomato brown rugose fruit virus,ToBRFV)是桿狀病毒科Virgaviridae煙草花葉病毒屬的一個新種。自2014年首次在以色列發現以來,ToBRFV發生蔓延的速度極快,在歐洲、美洲、亞洲和非洲的多個國家對番茄或辣椒等作物的生產造成重大威脅,被歐洲和地中海植物保護組織(European and Mediterranean Plant Protection Organization,EPPO)列為警戒名單。2021年4月ToBRFV被農業農村部列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》。本文將綜述ToBRFV的發現與分布、基因組結構、傳播方式、寄主范圍、檢測方法以及防控措施等內容,為控制ToBRFV在我國的擴散與危害提供基礎。

1 ToBRFV的發現與分布

2014年10月,以色列南部Ohad村莊溫室內約12.14 hm2的番茄出現輕微或重度花葉,偶爾葉片變窄,果實呈現黃色斑點的癥狀[2]。隨后不到一年,該病害就已傳播到以色列大多數番茄種植區,但當時并不清楚危害番茄的病原物類型[2]。2015年4月,約旦溫室栽培的番茄出現輕微花葉、葉片畸形的癥狀,且果實出現嚴重的褐色皺紋,發病率接近100%,極大地影響了番茄的商品價值;利用分子生物學和生物信息學等手段對危害番茄的病原物進行鑒定,發現約旦的發病番茄是由一種新的煙草花葉病毒屬病毒(tobamovirus)引起的,命名為番茄褐色皺紋果病毒[3]。2017年,以色列報道了2014年其南部暴發的番茄病害的病原物與約旦報道的ToBRFV約旦分離物的基因組序列高度相似,且能侵染攜帶Tm-1、Tm-2、Tm-22抗性基因的番茄品種和攜帶L1,3,4抗性基因的辣椒[2]。2018年9月,在墨西哥米卻肯州的幾個種植番茄和辣椒的農場中首次檢測到ToBRFV病毒[4],這是關于ToBRFV在自然條件下侵染辣椒的首次報道。隨后,ToBRFV呈現快速擴展、嚴重危害的態勢,尤其在番茄主產區的擴散速度更快,危害性也更大。

目前該病毒已在亞洲、歐洲、北美洲和非洲的35個國家被發現并報道[5],分別為:歐洲的德國[6]、意大利[7]、土耳其[8]、希臘[9]、荷蘭[10]、英國[11]、西班牙[12]、法國[13]、挪威[14]、瑞士[15]、阿爾巴尼亞[16]、塞浦路斯、比利時、波蘭、捷克、馬耳他、匈牙利、保加利亞、奧地利、愛沙尼亞、斯洛文尼亞和葡萄牙;美洲的墨西哥[4]、加拿大[17]和美國[18-19];亞洲的以色列[2]、約旦[3]、中國[20]、巴勒斯坦[21]、烏茲別克斯坦、伊朗[22]、沙特阿拉伯[23]、敘利亞[24]和黎巴嫩[24]以及非洲的埃及[25](表1)。這些國家包括6個位居世界前10位的番茄生產國(中國、美國、土耳其、意大利、西班牙和墨西哥)和2個世界主要番茄種子生產國(以色列和荷蘭)。我國于2019年4月首次在山東禹城溫室栽培的番茄上發現ToBRFV危害,發病面積0.27 hm2,發病率達50%[20];2020年在北京、陜西和云南元謀的番茄上也發現感染ToBRFV的番茄樣本[26-27]。

表1 番茄褐色皺紋果病毒在全球的發生分布情況1)Table 1 Distribution of ToBRFV around the world

2 ToBRFV的基因組結構與系統進化關系

ToBRFV的病毒粒體呈桿狀,長約300 nm,寬約18 nm;基因組為一條正義單鏈 RNA(+ssRNA),長約6.4 kb。與其他煙草花葉病毒屬病毒的基因組結構相似,ToBRFV的基因組包含5′和3′端非翻譯區以及4個開放閱讀框,分別為ORF1、ORF2、ORF3和ORF4 (圖1)。ORF1編碼約126 kD的復制酶,ORF2與ORF1的起始位點一樣,通過密碼子通讀的方式編碼183 kD的復制酶,ORF1和ORF2編碼的復制酶參與病毒的復制;ORF3編碼30 kD的運動蛋白(movement protein,MP),MP是ToBRFV突破Tm-22介導的抗性的重要因子[28-29];ORF4編碼17.5 kD的外殼蛋白(coat protein,CP),與病毒粒子的組裝和病毒的系統移動相關。

圖1 番茄褐色皺紋果病毒的基因組結構[27]Fig.1 Genome organization of tomato brown rugose fruit virus [27]

截至2022年3月,NCBI中已經登錄的ToBRFV的全長基因組序列多達78條。對ToBRFV及煙草花葉病毒屬的代表性病毒的全長基因組序列進行系統進化樹分析,發現ToBRFV與同屬的煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus,TMV)親緣關系較近﹐其次是番茄花葉病毒(tomato mosaic virus,ToMV)和番茄斑駁花葉病毒(tomato mottle mosaic virus,ToMMV)[2,5]。對ToBRFV的全長基因組序列與其他的煙草花葉病毒屬病毒的序列進行分析,發現ToBRFV與TMV的序列一致性最高,在82%左右,與ToMV和ToMMV的相似性在81%左右[2,27]。

3 ToBRFV的傳播方式

ToBRFV非常穩定且極易傳播和侵染。在溫室等保護性設施中,ToBRFV主要通過接觸傳播,是其近距離擴散的主要方式。帶毒的繁殖材料、被病毒污染的植物、衣服、手和水以及嫁接和整枝打杈等農事操作和農業器械均可以傳播ToBRFV[30]。種子傳播是ToBRFV遠距離傳播的主要方式之一。盡管ToBRFV僅存在于種皮中,但染毒番茄的種子100%帶毒[31-32]。雖然帶毒種子傳播ToBRFV的效率比較低,為0.08%～2.8%[33],但是被病毒污染的種子可作為初侵染源,一旦長成帶毒植株,病毒可通過接觸傳播進一步擴散蔓延。此外,帶毒種子一旦隨著進出口貿易擴散,在條件適宜的情況下,很容易在新的國家和地區定殖。有研究表明,授粉昆蟲熊蜂Bombusterrestris若攜帶ToBRFV,可在授粉時將ToBRFV傳播到健康的番茄植株上[34]。

4 ToBRFV的寄主范圍

在自然條件下,ToBRFV可侵染番茄和辣椒。一般來說,ToBRFV侵染番茄產生的典型癥狀包括花葉、葉上深綠色突起、葉片變窄、葉片畸形(圖2a),在番茄生長后期,果實可出現壞死、環斑(圖2b)。ToBRFV在番茄上的癥狀表現可能受番茄品種、危害時期和環境條件的影響。例如,ToBRFV約旦分離株在溫室感染的番茄葉片僅表現輕微花葉與畸形,而果實卻出現嚴重的褐色皺紋[3];ToBRFV在以色列南部的番茄上產生輕微或嚴重的花葉癥狀,且發病番茄上有10%～15%的果實出現黃斑癥狀[2]。ToBRFV危害辣椒主要引起植株發育遲緩,葉片花葉、斑駁、黃化和壞死斑,果實出現褐色皺紋。ToBRFV侵染辣椒所產生的癥狀也與品種密切相關。例如,ToBRFV能夠系統侵染含有L1或L2抗性基因的辣椒,而侵染含有L3或L4抗性基因的辣椒時會出現過敏性反應,從而限制ToBRFV的侵染[35]。

在實驗室條件下,除模式植物本氏煙Nicotianabenthamiana外(圖2c),ToBRFV還能系統侵染茄科、莧科、夾竹桃科和菊科的30余種植物[2-3,24,36-38]。ToBRFV系統侵染普通煙N.tabacum、心葉煙N.glutinosa、毛葉煙N.tabacumcv.‘sylvestris’、克利夫蘭氏煙N.clevelandi、澳可煙N.tabacumcv.‘occidentalis’、黃花煙N.tabacumcv.‘rustica’、三生煙N.tabacumcv.‘Samsun’、麥格隆熄豐煙N.megalosiphon、白肋煙N.tabacumcv.‘White Burley’、墻生藜Chenopodiummurale、藜C.album、千日紅Gomphrenaglobosa、一點紅Emiliasonchifolia、茼蒿Glebioniscoronaria等植物并產生癥狀;無癥侵染莧色藜C.amaranticolor、昆諾藜C.quinoa、曼陀羅Daturastramonium、洋金花D.metel、矮牽牛Petunia×hybrida和龍葵Solanumnigrum(或侵染后引起黃化癥狀)等植物;但該病毒不能侵染擬南芥Arabidopsisthaliana、含有N基因的三生煙、馬鈴薯Solanumtuberosum、茄子S.melongena和西葫蘆Cucurbitapepo等植物。

圖2 ToBRFV在番茄和本氏煙上的癥狀Fig.2 Symptoms induced by ToBRFV in tomato and Nicotiana benthamiana plants

5 ToBRFV的檢測方法

與很多植物病毒相似,ToBRFV發生后無藥劑可以治療,且ToBRFV可隨種子傳播。因此早期診斷監測預警是控制ToBRFV擴散蔓延的關鍵。目前已開發的ToBRFV的檢測方法主要包括用于檢測ToBRFV RNA的分子生物學方法以及用于檢測ToBRFV外殼蛋白的血清學檢測方法。

基于ToBRFV RNA的檢測方法包括RT-PCR、微滴式數字PCR、多重PCR、環介導等溫PCR (loop-mediated isothermal amplification,LAMP)和基于CRISPR/Cas的檢測[17,36-37,39-44]。RT-PCR和微滴式數字PCR具有較高的靈敏度和特異性,可用于檢測葉片和種子樣品中的ToBRFV。Yan等還針對ToBRFV、TMV、ToMV和番茄斑萎病毒開發了多重RT-PCR,可用于同時檢測待檢樣品中是否含有上述4種病毒[37]。然而,RT-PCR、微滴式數字PCR和多重PCR均需要精密的儀器以及專業的工作人員,無法直接在田間使用。LAMP是在等溫環境下反應,可通過肉眼觀察進行結果判斷,可用于在田間直接進行ToBRFV的檢測。

基于ToBRFV CP的檢測方法包括酶聯免疫吸附試驗(ELISA)以及膠體金免疫試紙條,高質量的抗體是該檢測技術建立的關鍵。Bernabé-Orts等[45]獲得了兩個能夠特異且靈敏識別ToBRFV的單克隆抗體,且與TMV和ToMV無交叉反應。2021年閆志勇等[46]開發了能夠在5 min之內快速檢測ToBRFV的膠體金免疫試紙條,作者與浙江大學合作獲得了能夠特異且靈敏識別ToBRFV的單克隆抗體,開發出了斑點免疫檢測試劑盒和膠體金免疫試紙條(數據未發表),為ToBRFV的快速檢測提供了重要工具。

6 防控建議

如前所述,ToBRFV發生之后無藥劑可以治療,且目前生產上缺乏抗ToBRFV番茄品種。為有效控制ToBRFV在中國的擴散與蔓延,需要構筑早期預警、準確監測和阻截控制三道防線。

首先,加強檢疫。ToBRFV可通過種子傳播。雖然ToBRFV隨種子傳播的效率比較低,但是一旦帶毒種子進入新的國家或地區,ToBRFV將進行遠距離傳播。選用無毒種子和種苗是控制ToBRFV的基礎。為避免ToBRFV在國內擴散,應設立疫區與非疫區,并強化番茄和辣椒種子或種苗調運監管,發現疫情及時處理與通報。

第二,加強監測預警。ToBRFV發生初期不容易被發現,顯癥后極易暴發流行。只有在病害發生初期檢測出病毒的種類,才能采取快速有效的干預措施,防止病毒的進一步擴散流行。因此,在番茄和辣椒主產區應加強巡查,發現ToBRFV病株及時銷毀。

第三,加強田園清潔。ToBRFV容易通過接觸傳播。在進行整枝打杈等農事活動時,盡量佩戴一次性手套和鞋套,每次處理新植株前需消毒器具。有報道表明,2%鹽酸處理30 min或者用10%磷酸三鈉處理3 h可將ToBRFV徹底消除;另外,0.5%乳鐵蛋白、2%裴賽斯(Virocid)、10%次氯酸鈉和3%衛可 (Virkon)對ToBRFV有90%以上的滅活效果[47-48]。

第四,選育抗病品種。利用抗病品種是防治病毒病最有效的方法。因ToBRFV能侵染攜帶Tm-1、Tm-2、Tm-22抗性基因的番茄品種,目前生產上尚無商品化的抗病品種。因此,應加強番茄、辣椒種質資源對ToBRFV的抗性評價,并將篩選出的抗性資源整合進行常規育種。此外,還應加強ToBRFV致病機制和植物抗病毒機制的研究,挖掘抗ToBRFV的基因,為研發培育抗ToBRFV新品種提供技術儲備。

7 結論

我國是世界上番茄、辣椒種植面積最大、生產總量最多的國家之一,番茄和辣椒是農民增收的重要支柱。自首次發現以來,ToBRFV在短短幾年的時間就迅速蔓延至全球35個國家。盡管目前在自然界中僅發現ToBRFV危害番茄和辣椒,但實驗室條件下ToBRFV的寄主范圍非常廣泛。雖然 ToBRFV 在中國番茄、辣椒產區只有零星發生,但我們仍有必要加強ToBRFV的檢疫和監測預警,警惕ToBRFV在我國的進一步擴散和蔓延。使用抗性品種是控制病毒病最經濟有效的手段,然而目前并沒有商業化的抗病品種。因此,亟須加強野生番茄等不同類型的種質資源的篩選,獲得ToBRFV的抗性材料;加強ToBRFV的侵染循環和致病機制的研究,并利用CRISPR/Cas等生物技術改造相應植物,為獲得抗病毒材料提供靶標和思路。