內源性神經干細胞在脊髓損傷修復中的研究進展

張 毅，張 強，曹 亮，羅張榮，李 青

脊髓損傷(SCI)是一種嚴重的、高度致殘的、致命的一種疾病，多由意外事故引起[1]。在SCI中，初始機械作用引起的原發性損傷存在不可逆的神經細胞死亡，繼而在炎癥、局部缺血、脂質過氧化和細胞凋亡等多種因素作用下導致繼發性損傷，最終造成軸突束斷裂，引起運動或感覺功能障礙[2-3]。目前仍未找到有效的SCI治療方法。當前SCI治療主要集中在以下2個方面[4-5]，一方面是神經保護，通過減少或消除繼發性病理反應以保護殘留軸突和神經細胞，如服用類固醇藥物[6]、托吡酯[7]、尼莫地平等；另一方面是神經再生和修復，通過促進神經元再生和重建突觸連接，如腦源性神經營養因子(BDNF)[8]治療、基因治療和神經干細胞(NSCs)治療[9]。NSCs療法被認為是治療SCI最有前景的方法[10]。NSCs主要存在于成人中樞神經系統(CNS)的腦和脊髓中[11-12]。NSCs在正常生理條件下保持靜止，在CNS損傷等條件下可以被激活[13]。激活的NSCs可以自我更新以維持干細胞庫并分化為用于組織修復的神經細胞。大量研究表明，神經元的病理性凋亡是SCI繼發性損傷的主要病理基礎[14]，適當誘導內源性神經干細胞(ENSCs)增殖分化為神經元以補償神經元的損失，是減少病理損傷、促進神經再生和修復SCI的有效方法[15-16]。在此我們總結了ENSCs的特征、在SCI治療中的意義及相關進展。

1 脊髓ENSCs的來源

在成人大腦和脊髓中發現了NSCs的存在，證明了CNS可能具有通過新生神經元修復損傷的潛力[11]。NSCs是CNS中的原始細胞，具有自我更新和多向分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的潛力。在創傷性腦損傷等病理條件下，NSCs的增殖和神經發生增加。這些新生成的神經細胞有能力遷移到損傷部位并替換受損神經元[17]。

在脊髓中，沿中央管排列的室管膜細胞具有體外分化為神經元和膠質細胞的能力，它們被定義為NSCs[18]。室管膜細胞(CD133+/FoxJ1+)、少突膠質祖細胞(NG2+/OLIG2+)和星形膠質細胞(GFAP+/Sox9+/Cx30+)均曾被研究者認為是脊髓干細胞[19]。在完整的脊髓中，室管膜細胞很少分裂，但在細胞培養中，室管膜細胞開始劇烈分裂，并通過產生星形膠質細胞、少突膠質細胞和神經元，表現出多能性[20]。SCI后，室管膜細胞開始快速分裂，并在膠質瘢痕中生成超過一半的星形膠質細胞和少量的少突膠質細胞，使軸突髓鞘化[20]。少突膠質祖細胞是成人完整脊髓中主要的分裂細胞群，它們在SCI后加速分裂，并產生大量的髓鞘化少突膠質細胞。星形膠質細胞在完整的脊髓內偶爾分裂以維持其數量。損傷后，星形膠質細胞迅速分裂，形成膠質瘢痕的邊界[20-21]。星形細胞和少突膠質祖細胞能夠自我更新，但其不是多能細胞，這表明它們不是干細胞[20]。然而，室管膜細胞在培養中和SCI后通過生成新的室管膜細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞而顯示出NSCs特性。因此，室管膜細胞代表了成人脊髓中潛在的神經干細胞群[22]。

1.1中央管內的脊髓NSCs 襯在中央管內的室管膜層被稱為脊髓NSC微環境。在小鼠脊髓中，室管膜細胞起源于中期胚胎階段(E15.5)，出生時完全包圍中央管[23]。根據對FoxJ1-CreER轉基因小鼠的研究，依據細胞形態室管膜細胞可分為3種基本類型：立方室管膜細胞、長柄細胞和放射狀室管膜細胞[19]。立方室管膜細胞是最豐富的多纖毛細胞，而放射狀室管膜細胞是數量較少的類型[24]。此外，在NSC微環境中還存在另一種細胞類型，即腦脊液-接觸神經元(CSF-CNs)[25]，這些細胞主要分布在脊髓中央管的室管膜層、脊髓周圍的實質及中腦和橋連接處的中腦導水管周圍灰質[26]。這些細胞的一側突出與腦脊液連接，而另一側與脊髓實質連接，從而形成“腦-腦脊液屏障”。CALLE等[27]也證實了CSF-CNs有2種信號傳遞方式：一種是通過突觸通訊，另一種是通過細胞間液體腦脊液介導的化學信號傳遞。最近的研究結果表明，CSF-CNs影響內源性神經祖細胞的表達和SCI后神經功能的恢復，并證實了PKD2L1+ CSF-CNs在體外具有NSCs的特性[28-29]。

1.2脊髓中央管室管膜細胞的異質性 研究表明，室管膜細胞具有異質性[30]。巢蛋白在室管膜細胞的背側和腹極表達，而CD15和BLBP在背側區域表達[18]。在成年小鼠脊髓中，含有巢蛋白的細胞數量以頸椎最多，胸椎次之，腰椎最少[31]。

2 脊髓ENSCs損傷后的反應

研究表明，NSCs在正常情況下保持靜止狀態或增殖非常緩慢，SCI會誘導脊髓ENSCs的激活[32]，并增殖、遷移至受損部位分化，參與組織的修復。因此，了解影響ENSCs激活的機制對SCI治療有重大意義。

2.1脊髓ENSCs的活化和增殖 內環境變化是影響ENSCs活化、增殖的主要因素，如可溶性因子、血管破壞導致的缺氧及免疫反應的增加，可能有助于CNS損傷后NSC的活化[32-33]。血管內皮生長因子(VEGF)、神經生長因子(NGF)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、BDNF等生長因子在NSCs的激活中也發揮重要作用[34-35]。HAN等[36]通過條件性基因敲除方法發現，VEGF能夠通過激活ERK通路和AKT通路促進NSCs的活化、增殖。有研究發現，bFGF可激活NSCs，促進其增殖分化為少突膠質祖細胞，增加腦實質中少突膠質細胞的數量，促進神經功能的恢復[37]。ZHANG等[38]將表達bFGF的NSCs移植到CNS損傷大鼠體內，發現bFGF能促進梗死區NSCs增殖、分化為成熟神經元。SCI后反應型星形膠質細胞產生的BDNF、神經營養因子-3(NT-3)、NGF和bFGF可促進血管重建，修復腦屏障，減輕水腫并阻止炎性細胞的擴散[16]。此外，還有研究表明，SCI激活免疫細胞觸發多種促炎和抗炎細胞因子的釋放，具有神經損傷與神經保護的雙重效果[39]。小鼠ENSCs與促炎M1巨噬細胞共培養可上調腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和白細胞介素(IL)-1β表達，并通過MAPK/Sox2信號通路促進其增殖，而與抗炎M2巨噬細胞共培養則誘導精氨酸酶和IL-10表達的上調，抑制細胞增殖，并促進向神經元分化[40]。

2.2脊髓ENSCs的遷移 SCI后3 d可以檢測到激活的ENSCs從中央管向病變部位遷移[19]。遷移的細胞會改變它們的形態并失去FoxJ1、Sox2和Sox3的表達[19]。報告顯示，病變部位募集的NSCs主要分化為星形膠質細胞，并在較小程度上分化為少突膠質細胞，但在損傷后不分化為神經元[19]。研究發現，炎性刺激物如干擾素-γ(IFN-γ)可激活小膠質細胞和星形膠質細胞合成趨化因子、細胞因子參與NSCs的遷移[41]。趨化因子基質細胞衍生因子-1α(SDF-1α)可趨化成年NSCs發生遷移，干細胞因子可趨化Nestin未分化細胞的遷移[42-43]。單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)能促進NSCs遷移至損傷部位[44]。因此，SCI后炎性細胞可促進趨化蛋白的表達，引導NSCs遷移。

2.3脊髓ENSCs的分化 損傷激活的脊髓NSCs定向遷移到損傷部位是利用ENSCs進行SCI再生修復的第一步。遷移的NSCs定向神經元分化是第二個需要解決的問題。神經元分化機制近年來也得到了廣泛的研究。早期研究發現SCI微環境中的Nogo-A通過激活信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)信號通路促進NSC向星形膠質細胞分化，而這可能是NSCs神經元分化所不能利用的[45]。此外，細胞外信號調節激酶(ERK)1/2和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路參與NSCs神經元分化的調控也已被證實。ERK1/2信號通路通過調節神經生長因子和細胞周期調節因子促進NSCs增殖，抑制神經元分化，而mTOR信號通路參與胰島素誘導的神經元分化[46-47]。髓鞘相關抑制因子(MAIs)是損傷微環境中抑制軸突再生的主要成分。最近研究發現，阻斷表皮生長因子受體(EGFR)-ERK信號可拮抗MAIs，通過ERK介導的三重基序含蛋白32(TRIM32)促進NSCs的神經元分化[48]。移植NSCs的結果可能受到SCI模型和供體細胞起源的差異影響。既往研究報道，擠壓和挫傷均可導致鼠或人NSC移植后少突膠質細胞分化，而部分或完全橫切可誘導星形膠質細胞分化[49]。還有研究表明，大鼠脊髓NSCs移植對星形膠質細胞分化的貢獻大于神經元[50]。這一證據表明，不利微環境中的多種因素阻礙了NSC向神經元分化，導致SCI部位神經元無法替代，最終阻礙了SCI后神經回路的重建和功能恢復。

3 促進ENSCs修復SCI的研究現狀

盡管外源性細胞移植可能會促進SCI修復，但是與移植手術相關的致癌風險、侵襲性和并發癥也應得到重視。此外，很難完全控制移植物的“命運”[51]。室管膜細胞已被證明是內源性脊髓NSCs。有尾兩棲動物等一些動物表現出強大的內源性神經發生能力，并且能夠在SCI后幾乎完全修復受損的脊髓功能[52]。海龜會自發地重新連接切斷的脊髓，在某些情況下會導致實質性恢復[53]。SCI治療的主要目標是受損軸突的再生和白質束的再髓鞘化。因此，刺激ENSCs是一種嘗試替代SCI后失去的神經元和膠質細胞的合理方法。然而，為了實現這一目標需克服NSCs微環境中廣泛存在的細胞和分子變化，如細胞死亡、炎癥、不同細胞群的反應性變化及細胞外環境分子組成的改變。最近研究表明，病理條件下ENSCs的行為確實可以調節，以促進中樞神經系統損傷后的功能恢復[54]。如ERLANDSSON等[54]發現使用免疫缺損NOD/SCID小鼠或與環孢霉素治療周圍性血管疾病模型，可增強SVZ衍生細胞向缺血損傷部位的遷移，使得細胞分化轉向膠質細胞。

可以確定幾個與治療相關的戰略目標。第一，增強膠質瘢痕的有益作用，減輕對軸突生長的抑制作用。SCI后形成的瘢痕長期以來被視為阻止軸突再生的物理屏障，大約一半的瘢痕相關星形膠質細胞來源于室管膜細胞。星形膠質細胞向瘢痕核心遷移并產生有助于軸突生長的層粘連蛋白[55]。GFAP+星形膠質細胞位于瘢痕邊緣，并分泌抑制軸突生長的硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)、腱生蛋白和信號素3[56]。一些研究表明，切除瘢痕組織中室管膜細胞衍生的星形膠質細胞或反應性星形膠質細胞會增強免疫細胞浸潤并導致病變體積擴大、神經元死亡增加和功能結果惡化[57]，阻斷室管膜細胞后代產生的瘢痕組織、病變的繼發性擴大及進一步的軸突丟失[58]。此外，最近的研究報道星形膠質細胞瘢痕有助于軸突生長，RNA測序顯示多種軸突生長分子在SCI星形膠質細胞和非星形膠質細胞中表達[59]。更有趣的是，在淡水龜中，活化的室管膜細胞有助于循環細胞的產生，循環細胞是SCI后允許軸突再生的重建橋架支架的重要組成部分[60]。上述研究表明這些細胞產生的瘢痕對SCI后恢復有不利和(或)有益影響。因此，增強NSCs來源的星形膠質細胞產生對能否進一步減少二次損傷和(或)在損傷部位創造一個促進生長的環境是有意義的。

第二，促進少突膠質細胞分化。脫髓鞘未修復區是SCI后的顯著特征，譜系追蹤研究顯示少突膠質細胞約占反應性室管膜細胞子代的3%[20]。這種低比例可能是由于IL-6相關細胞因子等星形膠質細胞促進因子和骨形成蛋白在損傷的脊髓中高表達所致。神經素-2過表達的神經球在移植到損傷脊髓時促進了少突膠質細胞分化，髓鞘化增強，導致運動和感覺功能的有益改變。

第三，促進神經元分化。損傷部位的神經元丟失是SCI后功能缺陷的主要原因。近年研究人員研發了能改善SCI微環境的多種生物材料，如復合凝膠和水凝膠等可為細胞提供支持，防止膠質瘢痕形成，并改善細胞分化微環境，促進神經元分化[61-62]。FAN等[63]研究表明神經營養因子膠原結合域(CBD)-西妥昔單抗功能單元(Fab)修飾的功能性膠原蛋白支架能夠在損傷微環境中持續釋放西妥昔單抗，并與NSC表面的EGFR結合，促進其在損傷部位的滯留，減少膠質瘢痕形成，改善運動功能。除了西妥昔單抗的修飾作用外，LI等[64]證明負載紫杉醇脂質體的有序膠原支架可以實現紫杉醇的緩慢釋放，改善再生環境，促進NSCs向神經元分化。此外，電針、火針、高壓氧等物理治療也可促進ENSCs的增殖、遷移和分化，有利于受損神經元再生[65]。研究表明，運動訓練能促進內源性室管膜細胞的增殖和分化，對SCI恢復發揮關鍵作用[66]。SIEGENTHALER等[67]指出，自愿鍛煉可減輕SCI后與年齡相關的修復缺陷，并且受傷的老年大鼠運動功能恢復率與未受傷年輕大鼠相當。

4 展望

SCI是世界性重大醫學問題，已引起廣泛的研究。然而，以下問題仍有待解決：①損傷誘導內源性巢蛋白陽性細胞來源。既往研究表明，脊髓橫斷后中央管的巢蛋白陽性細胞無法遷移到損傷部位[68]。然而近幾年報道顯示，損傷誘導的巢蛋白陽性細胞可遷移到損傷部位，通過定向誘導分化為神經元[64,69-70]。因此，探索損傷誘導的巢蛋白細胞起源對于未來的靶向治療策略具有重要意義。②神經再生微環境的必要組成部分尚不清楚。SCI后，軸突脫髓鞘和膠質瘢痕形成通過一個復雜的、不斷變化的過程阻礙神經再生，這個過程涉及許多信號分子和細胞類型[71]。盡管許多研究報道了相關分子的功能，但是這些分子在損傷后不同階段的具體作用尚未系統全面了解。③對不利微環境的調節，結合NSCs的再生機制，可促進SCI后神經回路的再生。中國科學家開展了膠原支架與干細胞結合的SCI修復的國際臨床研究，在SCI修復和再生醫學技術應用領域的臨床轉化研究中處于領先地位。最新研究進展可指導臨床治療改進，應對臨床SCI研究面臨的現有挑戰。相信不久的將來，通過深入研究，可解決上述問題，人類ENSCs移植治療終將變成現實。