DENV-2對HUVECs自噬小體形成和自噬體-溶酶體融合及溶酶體降解途徑的影響

胡盼， 茍小琴， 程瑤， 李志陽， 楊云巧， 何慧， 吳寧**

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 化學與生物化學實驗室， 貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 基礎醫學院 免疫學教研室， 貴州 貴陽 550004)

登革病毒(dengue virus, DENV)是一種隸屬于黃病毒科黃病毒屬的單股正鏈RNA病毒，編碼產生3個結構蛋白(衣殼蛋白C、膜蛋白M和包膜蛋白E)和7個非結構蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5)，DENV主要通過白紋伊蚊和埃及伊蚊等媒介傳播，已經成為世界上分布最廣、引起發病最多的病毒之一，主要流行于全球熱帶和亞熱帶地區[1-3]。全球DENV感染者每年約3.9億，DENV感染后尚無特異性治療藥物，大約12 500人因治療不及時、不當等而死亡[4-5]。自噬是細胞內物質降解途徑之一，包括自噬小體形成、自噬小體-溶酶體融合及溶酶體內自噬底物降解，完整自噬反應的發生對細胞內環境穩態的維持有著重要意義[6-7]。在病毒感染中，自噬起到雙重作用，既可抑制病毒的復制、又能促進病毒的增殖[8-10]。已有研究證明DENV可誘導自噬的發生，為病毒復制提供有利場所[11]，但DENV對自噬體-溶酶體融合以及溶酶體降解途徑的影響未見報道。因此，本研究以原代人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)作為研究對象，探究DENV-2對HUVECs自噬反應途徑的影響，在蛋白水平和細胞形態學水平揭示DENV-2對自噬流的作用機制，為進一步研究DENV在自噬水平的致病機制以及自噬的抗病毒反應提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

DENV-2 NGC株和C6/36由實驗室液氮保存，HUVECs和ECM培養基購自美國ScienCell公司，RIPA裂解緩沖液購自上海碧云天生物技術有限公司，Anti-微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ(LC3-Ⅱ，CST)和 Anti-自噬選擇性底物p62購自日本MBL公司，Anti- 突觸融合蛋白17(STX17)購自美國GeneTex公司，Anti-突觸體相關蛋白29(SNAP29)和Anti-囊泡相關膜蛋白8(VAMP8)購自英國Abcam公司，兔抗β-actin購自武漢愛博泰克生物科技有限公司， ECL化學發光試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；4 ℃低溫高速離心機為美國ThermoFishe公司產品，ABI StepOnePlusTM實時熒光定量PCR儀為美國 ThermoFisher公司產品。

1.2 研究方法

1.2.1DENV-2感染HUVECs 取HUVECs種植于6孔板(5×104/孔)，37 ℃，5% CO2培養箱中過夜，加入DENV-2孵育2 h，每30 min搖晃1次，最后1次棄去上清液，PBS洗滌1次，加入足量的培養液繼續培養。

1.2.2透射電鏡檢測自噬小體 收集36 h空白組(僅培養，未加入DENV-2孵育)和DENV感染組細胞沉淀，緩慢加入0.5%戊二醛固定液，重懸后4 ℃靜置10 min。12 000 r/min離心10 min，棄去上清，緩慢加入3%戊二醛固定液預固定，再用1%四氧化鋨再固定，使用丙酮溶液逐級脫水，然后利用Ep812包埋劑進行包埋，超薄切片機切片和展片后醋酸鈾染色15 min，再用檸檬酸鉛室溫下染色2 min，最后用JEM-1400FLASH透射電鏡進行圖像采集。

1.2.3Western blot法檢測 LC3Ⅰ/Ⅱ、p62、STX17、SNAP29和VAMP8的蛋白表達量使用RIPA裂解緩沖液從HUVECs細胞中提取總蛋白, 并用BCA蛋白試劑盒測定蛋白濃度, 蛋白樣品通過15%SDS-PAGE電泳,并轉印到PVDF膜。5%脫脂奶粉封閉2 h。孵育一抗LC3(1 ∶1 000)、p62(1 ∶1 000)、STX17(1 ∶1 000)、SNAP29(1 ∶1 000)、VAMP8(1 ∶1 000)、β-actin(1 ∶50 000)，HRP標記的山羊抗兔二抗(1 ∶8 000)孵育2 h，顯影底物A液和B液等比例混合避光顯影。使用Image J軟件進行各蛋白條帶灰度值分析。

1.2.4Lysotracker red 染色 根據試劑說明書提前使用完全培養基配制終濃度為75 nmol/L Lysotracker red工作液，37 ℃預處理，對空白組和DENV感染組用預冷的PBS洗滌2次，加入Lysotracker red工作液，37 ℃恒溫箱孵育1 h；去除上清液，加入新鮮細胞培養液后置于倒置熒光顯微鏡下觀察。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 DENV-2感染對HUVECs自噬小體形成的影響

透射電子顯微鏡結果顯示，DENV-2感染HUVECs 36 h后胞質內形成雙層膜包裹著未消化的細胞器的自噬小體(圖1)，表明DENV-2感染HUVECs后可誘導自噬小體的形成。

注：箭頭所示為自噬體，左圖比例尺為1 μm，右圖為500 nm。圖1 DENV-2感染HUVEC 36 h后的自噬體形成情況(透射電子顯微鏡)Fig.1 Autophagosome formation in HUVECs at 36 h after DENV-2 infection(transmission electron microscope)

2.2 DENV-2感染對自噬發生的影響

Western blot結果顯示(圖2)，DENV-2感染HUVECs 12、24、36及48 h時，與對照(Control)組比較， DENV-2感染組和自噬激動劑雷帕霉素RAPA組LC3-Ⅱ蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)，但60 h時3組LC3-Ⅱ蛋白表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；提示DENV-2感染 HUVECs 12、24、36及48 h均可激活自噬。

2.3 DENV-2對HUVECs自噬流的影響

Western blot檢測DENV-2感染HUVECs 2、4、6、8、10、12、18、24、30、36及48 h時的p62蛋白表達水平變化。結果顯示(圖3)，與對照(Control)組比較，DENV感染2、6、12 、30、36及48 h時的p62蛋白表達水平升高，差異有統計學意義(P<0.05)，且36 h p62蛋白表達水平到達峰值，隨后開始降低。提示DENV感染HUVECs 30 h后，自噬流受到阻礙。

注：(1)與空白組比較，P<0.05。圖2 DENV-2感染HUVEC不同時點的LC3蛋白表達Fig.2 Protein expression of LC3 in HUVECs at different time after DENV-2 infection

注：(1)與空白組比較，P<0.05。圖3 DENV-2感染HUVEC不同時點的p62表達Fig.3 Expression of p62 in HUVECs at different time after DENV-2 infection

2.4 DENV-2對自噬小體-溶酶體融合的影響

為了進一步探究DENV-2阻斷HUVECs晚期自噬流，利用Western blot檢測DENV-2感染HUVECs 24、30、36及48 h時的STX17、SNAP29 、VAMP8蛋白表達水平，結果顯示(圖4)，DENV-2感染組各時點的STX17蛋白表達水平低于對照(Control)組，差異有統計學意義(P<0.05)；DENV-2感染24 h時的SNAP29、VAMP8蛋白水平高于空白組 (P<0.05)，但30 h后SNAP29、VAMP8蛋白水平均低于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)。提示DENV-2感染HUVECs可阻礙自噬體和溶酶體的融合。

2.5 DENV-2影響溶酶體正常酸化阻斷自噬流

為了更進一步探究DENV-2阻礙自噬流的作用過程，采用Lysotracker red對DENV-2感染的HUVECs進行染色，倒置熒光顯微鏡觀察細胞內溶酶體pH的變化。結果顯示(圖5)，對照(Control)組細胞質中紅色亮點較多，且染色明亮，而DENV-2感染組顏色黯淡，紅色亮點明顯減少。提示DENV-2感阻礙了HUVECs溶酶體正常酸化，從而阻斷自噬流。進一步利用自噬晚期抑制劑CQ處理DENV-2感染的HUVECs，結果顯示，DENV-2感染24、36及48 h時，DENV-2感染組和CQ組LC3-Ⅱ蛋白表達水平均高于對照(Control)組(P<0.05)，且DENV-2感染組和CQ處理組的LC3-Ⅱ蛋白表達水平相近。提示DENV-2感染后期可以改變溶酶體內部的酸性環境，提高溶酶體的pH值。

注：(1)與空白組比較，P<0.05。圖4 關鍵自溶體融合蛋白STX17、SNAP29、VAMP8的相對表達Fig.4 Relative expression of key autolysosome fusion proteins STX17, SNAP29, and VAMP8

注：A為倒置熒光顯微鏡(100×)觀察未感染或感染DENV-2的HUVEC，B為DENV-2感染24、36及48 h時，HUVEC中LC3-Ⅱ蛋白表達水平結果，(1)與空白組比較，P<0.05。圖5 DENV-2影響HUVECS溶酶體的酸性環境Fig.5 Effect of DENV-2 on the acidic environment of HUVECS lysosomes

3 討論

DENV感染引起的DHF、DSS是致命的主要因素，主要表現為內皮細胞損傷導致血漿滲漏，目前認為血漿滲漏和多種機制相關，如細胞自噬抗病毒反應、炎性介質的釋放、內皮屏障蛋白缺失等[12-13]。細胞自噬作為維持細胞內環境穩態的重要途徑，能夠通過溶酶體降解胞內有害蛋白累積物、衰老的細胞器以及有害病原微生物等[14-16]。越來越多研究證明病毒感染和自噬各階段相互作用，尤其在誘導自噬發生的自噬-溶酶體融合和溶酶體降解階段[17-19]。DENV感染已證實能夠促進自噬，但其阻礙自噬體和溶酶體融合的分子機制并未闡明，也不清楚DENV對完整自噬反應后續階段溶酶體降解途徑的影響[20]。因此，本研究旨在探討DENV-2感染HUVECs后對自噬-溶酶體融合和溶酶體降解的影響。

Graybill等[18]的研究表明，水痘帶狀皰疹病毒(Varicella-zoster virus, VZV)介導自噬小體的形成，但阻斷了晚期自噬流和自噬體-溶酶體融合。類似的，本研究通過透射電子顯微鏡可觀察DENV-2感染后HUVECs自噬小體的形成，且Western blot結果顯示DENV-2感染組LC3-Ⅱ表達水平增加，p62蛋白在DENV-2感染早期無明顯變化，30 h后表達水平明顯增加，提示DENV-2感染能夠誘導自噬小體的形成，且能夠抑制晚期自噬流的發生。而自噬流通暢與否和完整自噬過程的自噬體-溶酶體融合、溶酶體降解途徑密切相關。自噬小體-溶酶體融合過程中，可溶性 N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE)發揮重要作用，SNARE系列蛋白中的STX17、SNAP29、VAMP8在自噬小體-溶酶體融合過程中緊密相連，三者缺一不可[21-22]。首先STX17被募集到成熟的自噬小體膜上，是融合的首要關鍵步驟，緊接著STX17的SNARE結構域和SNAP29相互作用，最后和VAMP8形成STX17-SNAP29-VAMP8復合物，促進自噬小體和溶酶體的融合，復合物中3個基因之一的敲低或敲除都會阻礙自噬小體和溶酶體的融合，從而阻斷自噬流[23]。本研究利用Western blot檢測DENV-2感染后期融合關鍵蛋白STX17、SNAP29、VAMP8的表達水平變化，結果顯示，作為首要融合關鍵蛋白的STX17 在DENV-2感染后表達水平明顯降低，而 SNAP29、VAMP8的表達水平在DENV-2感染24 h時高于對照(Control)組，但 24 h后SNAP29、VAMP8的表達水平均低與對照(Control)組，提示DENV-2感染晚期可阻斷自噬-溶酶體融合，這與STX17、SNAP29、VAMP8蛋白低表達水平有關，且阻斷融合和可能與DENV-2感染時間相關。DENV-2除了可抑制自噬-溶酶體融合，還可抑制溶酶體降解途徑。溶酶體降解途徑中溶酶體的酸化至關重要，一方面維持細胞的正常代謝與生長，另一方面有助于自噬對病原微生物的清除。當溶酶體功能紊亂時，即使自噬小體-溶酶體正常融合，自噬小體內底物卻無法降解，反而為病毒的復制提供更多膜結構，同時使得定位于自噬小體膜上的病毒進一步抑制自噬小體底物降解[24-25]。本研究利用Lysotracker red對DENV-2感染的HUVECs進行染色，結果發現DENV-2可以抑制溶酶體的正常酸化，提示DENV-2感染可以抑制溶酶體自噬性降解。自噬晚期抑制劑CQ可以提高溶酶體的pH值從而改變溶酶體內部的酸性環境，導致自噬體的降解，引起LC3-Ⅱ表達增加。本研究通過使用CQ進一步處理對照(Control)組和DENV-2感染組，結果發現，與對照(Control)組相比，DENV-2感染組與CQ組的LC3-Ⅱ蛋白表達水平增加，且DENV-2感染組與CQ組的LC3-Ⅱ表達水平相近，提示DENV-2感染可以影響溶酶體酸性環境。

綜上所述，本研究發現 DENV-2感染早期可激活HUVECs自噬，誘導自噬小體形成，感染晚期促使p62積聚，從而阻礙自噬流。DENV-2感染還可降低STX17、SNAP29、VAMP8的表達，證明DENV-2感染阻礙自噬小體-溶酶體融合過程，同時能夠抑制溶酶體正常酸化從而抑制溶酶體自噬性降解。本研究雖揭示了DENV-2感染對HUVECs完整自噬過程的影響，但DENV-2感染如何干擾溶酶體酸化的分子機制尚不清楚，因此，本研究下一步計劃從溶酶體酸化著手，進一步探究DENV-2感染對自噬的影響，從而為自噬抗病毒反應提供有力證據。