一株化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌生長特性研究

羅 俊，王娜娜，莊意瓊，應國紅，王曉煒

（深圳市藥品檢驗研究院，廣東 深圳 518057）

洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）是一種廣泛存在于水、土壤、植物和人體中的革蘭氏陰性桿菌。作為條件致病菌，能引起多種醫院感染，包括敗血癥、心內膜炎、肺炎、傷口感染和膿腫等，且該菌在患者和患者之間具有較強的傳播能力，由于其多重耐藥特性，治療相當困難，一旦在醫院內出現暴發流行很難控制[1-2]。目前該菌已經被FDA明確為不可接受微生物（objectionable microorganism）[3]，根據FDA網站數據顯示，從2019年1月至2021年8月因微生物污染被召回的26批化妝品中，有8批被洋蔥伯克霍爾德菌污染，占比高達31%[4]。筆者將實驗室近三年來微生物檢測不合格化妝品中污染菌分離鑒定后發現，洋蔥伯克霍爾德菌的檢出率遠高于《化妝品安全技術規范》[5]中要求的金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌，可見目前國內化妝品被洋蔥伯克霍爾德菌污染的風險較高。

在各領域現行的標準體系中，洋蔥伯克霍爾德菌定性檢驗方法有3種：SN/T 4684—2016《進出口化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌檢驗方法》[6]、SN/T 4485—2016《進出口口腔清潔類產品中洋蔥伯克霍爾德菌檢驗方法》[7]及USP＜60＞Microbiological examination of nonsterile products-test for Burkholderia cepacia complex[8]。而筆者在化妝品中分離到的一株洋蔥伯克霍爾德菌，在上述3種檢驗方法中的選擇性培養基中均無法生長，如果污染了該分離菌的樣品采用這3種方法檢驗，則無法檢出，因此提升化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌檢驗方法的適用性很有必要。本文以該樣品分離菌及3株洋蔥伯克霍爾德菌標準菌株作為測試菌，選取3種標準中使用的液體培養基，開展生長特性研究；并通過測試慶大霉素對各試驗菌的最低抑菌濃度，非目標菌抑制試驗以及藥敏試驗等，分析了該分離菌無法被檢出的主要原因，確定檢驗方法中最優的抗生素添加劑，并以此為依據對化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌的檢驗方法提幾點改進建議。

1 儀器與材料

1.1 儀器

MSC-Advantage A2型生物安全柜，BF400恒溫培養箱，GF54DA立式自動壓力蒸汽滅菌器。

1.2 菌株

洋蔥伯克霍爾德菌：1株為本實驗室從樣品中分離獲得（編號A，同下文），另3株標準菌株分別為ATCC 25416、ATCC BAA-245及ATCC BAA-247，來自美國典型菌種保藏中心。

非目標菌：金黃色葡萄球菌CMCC（B）26003、大腸埃希菌CMCC（B）44102、乙型副傷寒沙門氏菌CMCC（B）50094及銅綠假單胞菌CMCC（B）10104，均來自中國醫學細菌菌種保藏管理中心。

1.3 培養基及配套試劑

1.3.1 USP＜60＞培養基

pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液（pH7.0），TSB以及洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂（BCSA++）均來自廣東環凱。

1.3.2 SN/T 4684—2016培養基

含慶大霉素的洋蔥伯克霍爾德菌增菌液（BCSB+），含多黏菌素B的SCDLP增菌液（SCDLP+），含多黏菌素B和慶大霉素的洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂（BCSA+）及含多黏菌素B和慶大霉素的麥康凱瓊脂培養基（MAC+）來自青島海博。

1.3.3 SN/T 4485—2016培養基

SCDLP，改良letheen肉湯（MLET）來自廣東環凱，BCC培養基（BCA++）來自北京三藥。

1.3.4 配套試劑洋蔥伯克霍爾德菌選擇性瓊脂（BCSA）配套試劑來自廣東環凱，BCC培養基配套試劑來自北京三藥。

1.3.5 其他培養基TSA、麥康凱瓊脂培養基（MAC）均來自廣東環凱；TSA對照培養基來自中檢院。

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1.4 試劑

（1）生理鹽水：按GB 7918.1—1987依法配制。

（2）慶大霉素溶液（1 mg/mL）：購自青島海博。

2 方法

2.1 不同濃度菌懸液的制備

取4株洋蔥伯克霍爾德菌劃線至TSA平板，置32.5℃培養24 h，配制成2.0左右麥氏濃度的菌懸原液，備用；再用無菌生理鹽水稀釋至含量為每1 mL含101、102、103、104cfu的菌懸液，備用。

取5株非目標菌劃線至TSA平板，置32.5℃培養24 h，再用無菌生理鹽水稀釋至含量為每1 mL含104cfu的菌懸液，備用。

2.2 液體培養基的生長特性研究

取2.1項下4株洋蔥伯克霍爾德菌的101、102、103菌懸液1 mL接種至各液體培養基中，每種濃度每種培養基制備1管，置32.5℃培養，逐日觀察結果，必要時，劃線至TSA培養基培養，以確認是否有菌生長。

2.3 慶大霉素對各試驗菌的最低抑菌濃度（MIC）[9]測定

取1.4（2）慶大霉素溶液1 mL，用無菌TSB作為稀釋液，稀釋50倍至20μg/mL，再按二倍稀釋法[10]，分別稀釋至10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125μg/mL，制成裝量為10 mL的培養管，每個質量濃度各平行制備3管，每管接種2.1項下4株洋蔥伯克霍爾德菌的菌懸原液各100 μL，取無慶大霉素的TSB管接種相應試驗菌作為陽性對照管，置32.5℃培養48～72 h，用肉眼觀察其渾濁度，并記錄渾濁管數。

2.4 非目標菌抑制試驗

按2.3項下制備的含0.625μg/mL慶大霉素的TSB管，分別接種2.1項下金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門氏菌及銅綠假單胞菌菌懸液各100 μL，取無慶大霉素的TSB管接種相應試驗菌做為陽性對照管，置32.5℃培養48～72 h，用肉眼觀察其渾濁度，并記錄渾濁管數。

2.5 藥敏試驗

用無菌棉簽將4株洋蔥伯克霍爾德菌的TSA培養物挑取至相應的鑒定肉湯中，配制成0.5～0.6麥氏濃度的菌懸液，每株試驗菌各取1支藥敏肉湯，分別滴加1滴藥敏指示劑，再取已制備好的各試驗菌菌懸液25 μL分別轉移至藥敏肉湯中，混勻，將鑒定肉湯和藥敏肉湯分別倒入鑒定/藥敏板中，依法上機測試。

3 結果與分析

對比3種標準的培養體系，詳見表1，3種標準均采用了傳統的增菌后劃線分離的方法，但使用的培養基各有不同。

表1 3種洋蔥伯克霍爾德菌檢驗方法的培養基列表

3.1 液體培養基生長特性研究

為了考察菌株A在各標準培養體系中的生長情況，本研究選取了TSB、SCDLP+、BCSB+和MLET等4種液體培養基，以菌株A及3株洋蔥伯克霍爾德菌標準菌株作為試驗菌，開展生長特性研究。液體培養基生長特性研究結果表明，不同濃度的標準菌株在各液體培養基中均生長良好，并無顯著性差別，詳見表2；但各濃度的菌株A在BCSB+中均無法生長，且在培養基SCDLP+、TSB和MLET中，也出現不同程度的生長緩慢情況，為進一步探究菌株A在BCSB+中不生長的原因，對各培養基的成分表進行分析，詳見表3。

表2 液體培養基生長特性研究結果

各濃度的菌株A在BCSB+均不能生長，說明該培養基缺少該菌株生長必需的某種營養成分，或該培養基中有抑制菌株A生長的成分。葡萄糖、蔗糖、乳糖及牛肉膏等為培養物提供碳源，酪蛋白胰酶消化物、蛋白胨/大豆蛋白胨、大豆粉木瓜蛋白酶消化物和酵母提取物等為培養物提供氮源，氯化鈉維持滲透壓，酚紅為pH指示劑，結晶紫可抑制革蘭氏陽性菌及部分真菌生長，慶大霉素可抑制革蘭氏陰性菌及部分革蘭氏陽性菌生長[11]。仔細分析表3不難發現，各培養基中的碳源、氮源及滲透壓調節劑基本一致，pH并無顯著性差別，可見BCSB+中并不缺少該菌株生長必需的某種營養成分，且菌株A為革蘭氏陰性菌。由此推斷，慶大霉素可能抑制了該菌的生長。

表3 3種檢驗方法涉及的液體培養基配方

3.2 慶大霉素對各試驗菌的最低抑菌濃度（MIC）測定

由表4可知，3株標準菌株在含0.3125～20 μg/mL慶大霉素的TSB中均生長良好，而菌株A在含1.25～20μg/mL慶大霉素的TSB中均無法生長，僅在含0.312 5～0.625 μg/mL慶大霉素的TSB中可以生長，可見標準菌株對慶大霉素的耐受度較高，而菌株A對慶大霉素較敏感，所以慶大霉素對菌株A的MIC為0.625 μg/mL，慶大霉素對3株標準菌株的MIC均大于20 μg/mL。

表4 慶大霉素對各試驗菌的MIC測定

3.3 非目標菌抑制試驗

慶大霉素作為抗生素添加劑添加至選擇性培養基中，是為了抑制非目標菌的生長，從而提升目標菌的檢出率[11]。而慶大霉素是一種氨基糖苷類抗生素，主要用于治療細菌感染，尤其是革蘭氏陰性菌引起的感染，革蘭陽性菌中，金黃色葡萄球菌對本品敏感[12]。故本次試驗選取了對慶大霉素相對敏感的4株非目標菌，分別為金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、沙門氏菌及銅綠假單胞菌等作為試驗菌。實驗結果表明（表5）：該質量濃度的慶大霉素能抑制一定程度的金黃色葡萄球菌及銅綠假單胞菌，但無法抑制大腸埃希菌和沙門氏菌。如果將培養基配方中慶大霉素的含量降低至0.625μg/mL時，則不能達到抑制非目標菌的效果。

表5 非目標菌抑制試驗

3.4 藥敏試驗

由上文可知，洋蔥伯克霍爾德菌選擇性培養基中添加慶大霉素，會導致菌株A無法檢出，為了篩選出更多可以替代慶大霉素的抗生素添加劑，采用全自動微生物鑒定及藥敏系統，取4株洋蔥伯克霍爾德菌TSA純培養物上機測試。該設備可完成試驗菌的鑒定以及各抗生素最低抑菌濃度的定量藥物敏感性測試，試驗結果見表6，慶大霉素對4株洋蔥伯克霍爾菌的測試值與上文中MIC測試結果基本一致，3株標準菌株大于藥敏板上限值（8μg/mL），菌株A低于藥敏板下限值（2μg/mL）。另外，當4株菌的某種抗生素測試值均大于其上限值時，說明目標菌對這種抗生素的耐受度較高，有應用于化妝品中洋蔥伯克霍爾菌的檢測方法的可能性，符合條件的抗生素分別為頭孢唑林、氨芐青霉素及四環素等。

表6 藥敏試驗結果 μg·mL-1

4 結束語

洋蔥伯克霍爾德菌是洋蔥伯克霍爾德菌菌群中最常見的菌株之一，該菌群有20余種[13]，菌株A對慶大霉素非常敏感，但3株標準菌株耐受度較高，可見該菌群內各菌株生長特性各異?；诖?，本研究對化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌的檢驗方法提出幾點改進建議。

首先應優化添加抗生素的種類及質量濃度，頭孢唑林、氨芐青霉素及四環素等均可作為慶大霉素抗生素的替代品，但具體添加質量濃度還有待于進一步試驗研究；另外李詩瑤等[14]在沙門氏菌的定性檢驗時，采用了多種選擇性平板進行劃線分離，顯著提高檢出率。王似錦等[15]在對凝膠劑中1株洋蔥伯克霍爾德菌的生長特性研究結果表明，該菌在選擇性培養基麥康凱瓊脂和紫紅膽鹽瓊脂培養基中也生長良好?？梢娫诨瘖y品中洋蔥伯克霍爾德菌的檢驗方法中，也可聯用多種選擇性平板作為劃線分離平板，在兼顧選擇性及目標菌生長特性的同時，提升檢出率。