基于網絡藥理學探討金鈴子散改善痛經的作用機制*

李夢華，田麗穎，2△

1安徽中醫藥大學研究生院，安徽 合肥 230038；2安徽中醫藥大學第二附屬醫院

原發性痛經（primary dysmenorrhea，PD）是一種無盆腔器質性病變的痛經，也被稱為功能性痛經，其表現為月經前后或者每個月經期出現下腹肌肉痙攣性痛經，嚴重者還會伴有頭痛、惡心、嘔吐、腰腿肌肉酸痛。臨床醫學研究［1］表明，PD的發病機制主要與前列腺素、加壓素、催產素、雌二醇和內皮素等有關，此外，內分泌功能失調也會導致子宮平滑肌/血管痙攣性收縮，或產生、釋放致痛物質引發痛經。目前臨床上西醫學主要以口服非甾體抗炎藥和避孕藥治療為主。中醫藥治療PD方法多樣，療效可靠，且副作用少，外治以針刺治療為主，內治以中藥內服治療為主，處方用藥多以經方為主，主要方劑有四物湯、歸脾湯、溫經湯、金鈴子散、四逆散、少腹逐瘀湯加減方等。

金鈴子散出自《素問病機氣宜保命集》，此書作者為“金元四大家”之一——劉完素。全方組方簡練，僅由延胡索、川楝子成方，具有疏肝行氣、活血散瘀、瀉熱止痛的功效。常用于肝氣郁結化火、脾胃氣滯不暢、肝胃不和引起的胸脘及脅腹部位疼痛，還可用于疝氣、月經期腹部疼痛等。川楝子苦寒，有小毒，長于泄氣分之實熱，以行理氣止痛之功效；延胡索味辛、苦，性溫，長于行血氣之滯。二藥配伍，寒溫結合，理氣行血，具備止痛之功效。金鈴子散的使用歷史悠久，成方精簡，療效確切，在臨床上應用廣泛。

網絡藥理學是一門新興的研究技術，它將傳統藥理學中優秀的思維模式與現代先進技術及內容相結合，如生物信息學、系統生物學、計算生物學及網絡分析學等不同學科，通過構建“藥物-靶點-疾病-靶點”的網絡體系，展示藥物復方的作用機制［2］。網絡藥理學以整體的角度探討藥物與疾病之間的關聯及“多成分-多靶點”的作用關系，與祖國醫學的辨證論治理念和整體觀念殊途同歸［3］。因此，基于上述理論研究，筆者采用中藥網絡藥理學的方法分析傳統中藥復方金鈴子散治療PD的作用靶點，并分析其可能的作用機制，為金鈴子散治療PD的臨床應用及研究提供可靠的理論依據。

1 資料與方法

1.1 金鈴子散相關靶點篩選運用中醫藥系統藥理學平臺［4］（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）尋找金鈴子散的2味中藥化學組成成分，檢索詞為“延胡索”“川楝子”，設置ADME屬性為口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.18［5］，篩選出2味中藥潛在的有效活性成分，刪除未找到靶點的部分，檢索出與金鈴子散活性成分有關的潛在靶點。通過Uniprot數據庫［6］（https：//www.uniprot.org/），將物種選定為“human”，查詢各個靶點對應的基因名稱，并獲得規范的官方標準名稱。

1.2 PD相關靶點篩選利用人類基因（Gene-Cards）［7］、在線人類孟德爾遺傳（online mendelian inheritance in man，OMIM）［8］數據庫、藥物靶點（therapeutic target database，TTD）數 據庫［9］，在數據庫中分別輸入關鍵詞“primary dysmenorrhea”“dysmenorrhea”，檢索與PD相關的基因靶點，合并獲取的靶點后，去除重復值得到PD靶點，經Uniprot數據庫校正基因名稱。

1.3 構建金鈴子散對PD靶點的預測以及“藥物-疾病”蛋白互作網絡在R語言中將金鈴子散的藥物相關靶點與PD疾病靶點進行對比分析，取得交集靶點并以韋恩圖展示。進而將所獲取的交集靶點導入STRING數據庫（https：//cn.string-db.org/）獲得PPI網 絡 模 型［10］，選 定生 物種 類為“Homo sapiens”，設定為“highest confidence”（0.9），隱藏游離節點，默認其余設置，提交后得到PPI網絡。導出包含作用節點關系信息的tsv文件，并輸入Cytoscape 3.7.0軟件［11］，構建“藥物-疾病”蛋白互作網絡。

1.4 GO富集和KEGG通路分析將金鈴子散與PD的交集靶點導入David 6.8數據庫［12-13］（https：//david.ncifcrf.gov/）進行GO富集分析，物種選擇為“Homo sapiens”，設定P值小于0.01，通過David 6.8數據庫的功能注釋（functional Annotation）工具對GO富集分析下的細胞成分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）進行分析。運用David 6.8進行KEGG通路富集分析，獲得金鈴子散治療PD的相關生物學過程和各條關鍵的作用通路。

1.5 構建金鈴子散“活性成分-靶點-通路”的可視化網絡圖運用Cytoscape 3.7.0軟件對金鈴子散活性成分及相關靶點進行可視化分析，構建金鈴子散“活性成分-靶點-通路”的可視化網絡圖，進而分析得出金鈴子散治療PD的關鍵活性成分、靶點、通路。

2 結果

2.1 金鈴子散有效活性成分初步篩選出延胡索化學成分77個，川楝子化學成分33個，經吸收、分布、代謝、排泄（absorption，distribution，metabolism，and excretion，ADME）篩選后，獲得延胡索化學成分49個，川楝子化學成分6個；刪除無對應靶點的部分，最終獲得有效化學成分54個見表1。延胡索成分作用靶點1036個，川楝子成分作用靶點176個，合并后去除重復值，得到207個潛在作用靶點。

表1 金鈴子散活性成分

2.2 PD相關靶點通過Genecards數據庫獲得痛經靶點301個，PD靶點299個。設定Score大于中位數的目標靶點為痛經的潛在靶點，如通過GeneCards所收集PD靶點Score最大值為40.49，因為所得最小值是0.9，所得中位數是8.77，所以將Score值設定為大于8.77，所得靶點即為PD的潛在疾病靶點。聯系結合TTD、OMIM、DRUGBANK數據庫補充完整痛經的疾病靶點，合并所有結果，刪除重復值，得到683個相關靶點。

2.3 金鈴子散活性成分-PD靶點PPI網絡的構建將篩選的金鈴子散活性成分靶點和痛經疾病靶點進行對比，獲得交集靶點，繪制韋恩圖見圖1，得到金鈴子散成分-痛經交集靶點59個。將交集靶點提交至STRING 11.0平臺，得到金鈴子散靶點PPI網絡，下載tsv文件并導入Cytoscape 3.7.0軟件中進行拓撲分析得到PPI網絡圖，圖2。圖中節點的degree值越大，則面積越大、越接近黃色，表示該節點在PPI網絡圖中作用越重要。金鈴子散治療PD的靶點中degree值排名前10的是TP53、VEGFA、AKT1、EGFR、IL6、TNF、FOS、MYC、CCND1、ESR1，表明它們可能是調治痛經的關鍵靶點。見表2。

圖1 金鈴子散藥物成分-痛經靶點韋恩圖

圖2 金鈴子散靶點PPI網絡圖

表2 金鈴子散調治PD的主要靶點

2.4 GO富集分析將59個藥物-疾病交集靶點導入數據庫David 6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進行GO富集分析，設定物種為Homo sapiens，P值小于0.01，進行GO功能富集分析，其中涉及的生物學過程（biological process，BP）156個，主要包括蛋白質磷酸化的正調節、藥物反應、細胞對有機環狀化合物的反應、基因表達的正調控、正調控轉錄，DNA模板化、炎癥反應、正向調節、對制動應激的反應、胞增殖的負調控、RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控等。涉及分子功能（molecular function，MF）40個，主要包括酶結合、轉錄因子結合、RNA聚合酶Ⅱ轉錄因子活性，配體激活序列特異性DNA結合、類固醇激素受體活性、類固醇結合、相同的蛋白質結合、氧化還原酶活性、蛋白質異二聚活性、蛋白質結合、序列特異性DNA結合等。涉及細胞組成（cellular component，CC）15個，主要包括細胞外間隙、細胞外區域、細胞器膜、蛋白質復合體、軸突末端、膜筏、血小板α顆粒管腔、質膜、內質網膜、蛋白質細胞外基質等。根據P值大小，將顯著性前10的條目進行可視化，見圖3。

圖3 GO富集分析

2.5 KEGG富集分析KEGG是包含了細胞和生物高級功能的注釋的數據庫，包括KEGG路徑圖，BRITE層次結構和KEGG模塊［14］。對金鈴子散59個潛在靶點KEGG通路進行富集分析共得到85條信號通路，根據P值小于0.01，篩選得到53條信號通路，主要涉及癌癥通路、蛋白多糖與癌癥、癌癥中的MicroRNA、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、FoxO信號通路、p53信號通路、HIF-1信號通路等，提示金鈴子散通過多通路、多靶點起到調治PD的作用。排名前20的信號通路見圖4。

圖4 KEGG信號通路富集分析

2.6 “活性成分-靶點-通路”網絡圖的構建將所得數據導入Cytoscape 3.7.0軟件，構建金鈴子散“活性成分-靶點-通路”可視化網絡圖（圖3），其中黃色菱形表示的是延胡索的48個活性成分，綠色橢圓形表示的是川楝子的5個活性成分，藍色三角形表示2味中藥共有的1個相同活性成分，藍色矩形表示靶點，紅色倒三角形表示信號通路。通過Cytoscape軟件的NetworkAnalyzer插件分析金鈴子散治療PD網絡拓撲學參數，得到金鈴子散治療PD的核心成分及核心靶點，按degree值排列。經Cytoscape分析顯示，槲皮素quercetin節點度值（Degree）為302，預測槲皮素為金鈴子散治療PD的最主要活性成分，隨后依次為金黃紫堇堿（S）-Scoulerine（Degree值36）、四氫非洲方己堿Isocorypalmine（Degree值35）、羅通定Hyndarin（Degree值32）、獅足草堿leonticine（Degree值32），見圖5。

圖5 “活性成分-靶點-通路”網絡

3 討論

根據是否有盆腔臟器的器質性病理改變可將痛經分為兩類，分別為PD和繼發性痛經。PD無盆腔臟器的器質性病變，以青少年期多見，多發生于月經初潮后半年到1年內，影響女性的正常生活。國內研究顯示，中國女性痛經發生率為33.1%，其中PD占53.2%，痛經嚴重影響工作者占13.53%［15］。研究中藥對PD的調治方法具有重要臨床價值和意義。我國傳統醫學中，痛經被稱為“經行腹痛”，最早見于《金匱要略·婦人雜病脈證并治》：“帶下，經水不利，少腹滿痛，經一月再見?！保?6］中醫藥調治PD的效果不亞于現代臨床藥物，在緩解疼痛和調理月經方面療效明顯。

本課題利用網絡藥理學的方法初步篩選，得出金鈴子散調治PD的主要活性成分有槲皮素、金黃紫堇堿、四氫非洲方己堿、羅通定、獅足草堿等。槲皮素是金鈴子散中兩味中藥的共有成分，也是此方劑中對應靶點最多的活性成分，是一種具有強抗炎能力的長效抗炎物質［17］。有學者［18］認為，槲皮素及其衍生物是炎癥和疼痛管理的有用工具，并提出槲皮素的鎮痛活性是源于其抗炎特性的觀點。

金鈴子散調治PD主要通過TP53、VEGFA、AKT1、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）發揮作用。PD的病理生理學主要與前列腺素（prostaglandin，PG）水平升高有關［19-20］。TP53編碼的蛋白對多種細胞應激反應，調節表達靶基因，從而誘導細胞周期的改變［21］。T細胞分泌的炎性因子IL-6通過誘導炎癥反應引起子宮平滑肌缺血缺氧，造成局部炎性反應，使宮腔內組織壞死導致痛經［22］。蛋白激酶B1與血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）可參與調節血管重塑及血管再生的重要過程，在月經期AKT1可能有利于修復子宮內膜，或許與AKT1可以促進新生血管內皮生長有關。

根據GO和KEGG通路富集分析顯示，金鈴子散治療PD主要涉及癌癥通路、PI3K-AKT信號通路、TNF信號通路、P53信號通路等。KEGG富集結果表明金鈴子散能通過多通路對PD起到治療作用。

綜上所述，金鈴子散是通過多靶點多通路起到調治PD作用的。它主要通過對關鍵靶點TP53、VEGFA、AKT1、EGFR以及IL6的表達進行調節來達到目的。此外，它還作用于細胞生物過程，最終作用于炎癥相關通路（P53、TNF信號通路），從而抑制前列腺素的合成及相關的炎性反應，減少子宮異常收縮帶來的缺血缺氧、緩解疼痛，達到對PD的治療目的。但本研究限于網絡數據庫和數據軟件分析層面上，后續需在動物實驗上加以驗證，以求完善。