滅菌唑與氰烯菌酯復配對水稻惡苗病菌的抑制活性

李美霞, 陳香華, 周長勇, 陳亞麗, 朱春華,曹凱歌, 王建新, 周明國, 段亞冰*,

(1. 江蘇徐淮地區淮陰農業科學研究所，江蘇 淮安 223001；2. 南京農業大學 植物保護學院 農藥系，南京 210095；3. 江蘇省南京市六合區春華家庭農場，南京 211500)

水稻惡苗病是由以藤倉鐮孢菌Fusarium fujikuroi為優勢種群引起的種傳真菌病害，在我國各稻區均有發生。發病植株表現為徒長、病苗細高，葉片葉鞘細長、葉色淡黃，根系發育不良；發病植株產生的分生孢子可借助氣流和雨水傳播，再次侵染谷粒和稻草，形成侵染循環，嚴重威脅水稻生產安全，部分病苗在移栽前死亡[1]，嚴重時可造成水稻減產50%以上[2]。病原菌在侵染水稻的同時，還可產生伏馬毒素及其他有毒次生代謝產物等，從而影響糧食安全[3-4]。目前由于缺乏抗病品種，生產中仍采用以種子處理為主的化學藥劑防治該病害[5]。

滅菌唑 (triticonazole) 屬于三唑類殺菌劑，主要用于防治禾谷類作物、豆科作物及果樹等真菌病害，對種傳病害有特效，且持效期長[6-7]，但我國目前尚未有滅菌唑用于防治水稻惡苗病的相關產品登記?；诖?，本研究擬開展滅菌唑對水稻惡苗病菌的室內抑制活性研究及其對水稻的安全性評價，以期為滅菌唑在水稻惡苗病化學防控上登記使用提供理論依據。

氰烯菌酯 (phenamacril) 屬于2-氰基丙烯酸酯類殺菌劑，能有效控制由鐮孢菌引起的小麥赤霉病、水稻惡苗病和西瓜枯萎病等多種植物病害[8]。研究表明，該藥劑對水稻惡苗病防控體現在對菌絲生長有較高的抑制活性，且浸種處理后對水稻整個生長期無不良影響，兼具保護和治療作用[9]。近年來，隨著氰烯菌酯用藥歷史的延長，水稻惡苗病菌對其的抗藥性問題日益加劇[10]。為了降低水稻惡苗病菌對氰烯菌酯的抗性風險，本研究擬進一步開展氰烯菌酯與滅菌唑混配對水稻惡苗病菌的聯合毒力測定，以期為科學使用不同浸種劑及延緩水稻惡苗病菌抗性群體的發展提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 供試材料

95%滅菌唑 (triticonazole) 原藥及25 g/L 滅菌唑種子處理懸浮劑 (FS)，均由巴斯夫歐洲公司提供；95% 氰烯菌酯 (phenamacril) 原藥由江蘇省農藥研究所股份有限公司提供。原藥均用甲醇溶解并配制成1 × 104μg/mL 的母液，置于4 ℃培養箱保存備用。

供試水稻品種為南粳5 055，蘇御糯。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基 (PDA)：200 g 馬鈴薯，16 g 瓊脂粉，20 g 葡萄糖，加蒸餾水至1 L。

供試菌株：分別從浙江省紹興地區 (編號為ZJSX-)、江蘇省淮安地區 (編號為JSHA-) 及江蘇省泰州地區 (JSTZ-) 采集典型水稻惡苗病感病植株，經組織分離和單孢純化獲得菌株，經形態學和ITS 測序鑒定為藤倉鐮孢菌Fusarium fujikuroi，于4 ℃培養箱保存，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 水稻惡苗病菌對滅菌唑的敏感性測定 采用菌絲生長速率法[11]。隨機選取10 株水稻惡苗病菌菌株，將其從4 ℃培養箱中活化轉移至空白PDA 平板上，于25 ℃培養6 d 后，用直徑5 mm打孔器于菌落邊緣約1/3 處打取菌碟，備用。將藥劑與PDA 培養基混勻，制成質量濃度分別為0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1 和2 μg/mL 的含藥平板，以加入等體積甲醇的PDA 平板作為對照，每濃度重復3 次，整個試驗重復3 次。25 ℃恒溫培養6 d 后，采用十字交叉法測量菌落直徑 (cm)，并計算不同濃度處理下藥劑對菌絲生長的抑菌率(I，%)，用DPS 數據處理軟件計算毒力回歸方程、有效抑制中濃度 (EC50) 及相關系數 (r)。

1.2.2 滅菌唑種子處理懸浮劑對水稻種子發芽率的影響試驗 稱量25 g/L 滅菌唑種子處理懸浮劑(FS)，分別制備成有效成分質量濃度為60、120和240 μg/mL 的藥液；稱取50 g 水稻種子，25 ℃恒溫于各質量濃度藥液中浸泡48 h。每處理重復3 次，以加入等量清水中浸泡的種子作為空白對照，整個試驗重復3 次。浸泡完成后，將種子擺放在潤濕的雙層濾紙上，于25 ℃、相對濕度85%條件下培養，5 d 后各處理隨機選取100 粒種子，計算發芽率。

1.2.3 滅菌唑種子處理懸浮劑對水稻株高和鮮重的影響試驗 水稻種子處理同1.2.2 節，將浸泡后的各處理種子種于一次性塑料杯中，每處理30 粒種子，21 d 后調查水稻株高和鮮重情況。

1.2.4 水稻惡苗病菌對氰烯菌酯的敏感性測定

隨機選取10 株水稻惡苗病菌菌株供試，試驗方法同1.2.1 節，PDA 含藥平板中氰烯菌酯終濃度 (質量濃度) 分別設置為：0、0.078、0.156、0.312 5、0.625 和1.25 μg/mL，每濃度重復3 次，整個試驗重復3 次。

1.2.5 水稻惡苗病菌對氰烯菌酯和滅菌唑復配藥劑的敏感性測定 供試菌株為ZJSX-4。將1 ×104μg/mL 的氰烯菌酯母液與滅菌唑母液分別以質量比4 : 1、3 : 1、2 : 1、1 : 1、1 : 2、1 : 3 及1 : 4進行混合，按照表1 中的質量濃度梯度處理，測定氰烯菌酯和滅菌唑復配藥劑對水稻惡苗病菌的抑制活性。采用Wadley 法評價聯合毒力[12]，計算氰烯菌酯和滅菌唑復配的增效系數 (SR)：SR ＞1.5為增效作用，1.5 ≥ SR ≥ 0.5 為相加作用，SR ＜0.5 為拮抗作用。

表1 水稻惡苗病菌敏感性測定試驗中氰烯菌酯和滅菌唑復配藥劑的濃度梯度Table 1 Concent ration gradients of the combinations of phenamacril and triticonazole for the sensitivity tests of F. fujikuroi

2 結果與分析

2.1 水稻惡苗病菌對滅菌唑的敏感性

菌絲生長速率法測定結果 (表2) 顯示：10 株惡苗病菌株對滅菌唑均表現敏感，EC50值在0.069 2～0.766 1 μg/mL 之間，表明滅菌唑對水稻惡苗病菌菌絲生長具有較高的抑制活性。

表2 水稻惡苗病菌對滅菌唑的敏感性Table 2 Sensitivity of F. fujikuroi to triticonazole

2.2 滅菌唑種子處理懸浮劑對水稻的安全性

南粳5 055 和蘇御糯水稻種子經不同質量濃度的25 g/L 滅菌唑種子處理懸浮劑處理后，其發芽率、株高、鮮重指標與清水對照均無顯著差異 (P=0.05) (表3)，表明25 g/L 滅菌唑種子處理懸浮劑對水稻安全性良好，可用于水稻惡苗病的化學防治。

表3 25 g/L 滅菌唑種子處理懸浮劑對水稻的安全性Table 3 Safety of 25 g/L triticonazole FS on rice

2.3 水稻惡苗病菌對氰烯菌酯的敏感性

菌絲生長速率法測定結果 (表4) 顯示：10 株惡苗病菌株對氰烯菌酯均表現敏感，EC50值在0.007 6～0.262 9 μg/mL 之間，表明氰烯菌酯對水稻惡苗病菌菌絲生長也具有較高的抑制活性。

表4 水稻惡苗病菌對氰烯菌酯的敏感性Table 4 Sensitivity of F. fujikuroi to phenamacril

2.4 氰烯菌酯和滅菌唑復配對水稻惡苗病菌的聯合毒力

同樣采用菌絲生長速率法測定了氰烯菌酯和滅菌唑各比例復配藥劑對水稻惡苗病菌的聯合毒力，結果 (表5) 顯示：氰烯菌酯與滅菌唑按不同比例復配后的增系數 (SR) 均在0.5～1.5 之間，表明復配表現為相加作用。

表5 水稻惡苗病菌對氰烯菌酯和滅菌唑各復配藥劑的敏感性Table 5 Sensitivity of F. fujikuroi to the combinations of phenamacril and triticonazole

3 結論與討論

水稻惡苗病又稱徒長病，是水稻生產中的重要病害之一[13-14]。20 世紀70 年代，苯并咪唑類殺菌劑被廣泛用于防治水稻惡苗病，但由于長期使用單一類型藥劑，田間水稻惡苗病菌抗藥性迅速發展，早在1982 年日本即報道了水稻惡苗病菌對苯菌靈已產生耐藥性[15]。20 世紀80 年代，咪鮮胺繼多菌靈后被大量應用，隨后其抗藥性問題也日益嚴重[16-17]。2002 年，劉永峰等[18]發現水稻惡苗病菌對咪鮮胺已產生抗藥性；2007 年，陳夕軍等[19]在田間分離到了8 株抗咪鮮胺的水稻惡苗病菌株；2014 年，鄭睿等[20]發現咪鮮胺高抗菌株已成為江蘇省水稻惡苗病菌的優勢群體。為了有效延緩水稻惡苗病菌的抗藥性，多種類型化學藥劑 (氰烯菌酯、戊唑醇、咯菌腈等) 和生防菌劑被陸續用于防治水稻惡苗病，剛開始應用時效果顯著，很好地控制了病害發生，但由于生產上慣用單一藥劑防治病害，田間先后出現了對這些藥劑具有不同抗性水平的病原菌群體，因此其抗藥性問題依然嚴峻。

氰烯菌酯自2007 年進入市場，并于2012 年開始登記用作水稻種子處理劑防治水稻惡苗病，該藥劑與多菌靈、咪鮮胺等無交互抗性[21]。2016年，侯毅平等[22]首次報道自浙江省紹興地區分離得到了9 株對氰烯菌酯高抗的水稻惡苗病菌菌株，其中8 株抗藥性基因型為myosin5 的第219 位密碼子由TCA (絲氨酸) →CCA (脯氨酸) 的突變，另外1 株抗藥性基因型為myosin5 的第219 位密碼子由TCA (絲氨酸) →TTA (亮氨酸) 的突變；2020 年，張智慧等[23]在江蘇省宿遷田間分離到的F.fujikuroi抗性菌株基因型表現為myosin5 第326 位密碼子由AGG (精氨酸) →AGT (絲氨酸) 的突變。隨著藥劑使用年限延長以及使用劑量和使用頻率增加，抗藥性問題日益嚴重。因此，研發殺菌劑協同增效組合技術是延緩病原菌抗藥性發展、延長藥劑使用年限的主要策略。

三唑類殺菌劑具備高效、廣譜、內吸性強等特點，具有保護和治療雙重作用，目前已成為滿足市場需求且最具有開發潛力的殺菌劑類型之一。但滅菌唑在防治水稻惡苗病方面還未有產品登記，也尚未見其對防治水稻惡苗病是否有效的相關報道。因此，研究滅菌唑對水稻惡苗病菌的抑制效果，能為水稻播種期病害防控提供重要參考。本研究表明，滅菌唑對水稻惡苗病菌具有較好的離體抑制活性，且25 g/L 滅菌唑種子處理懸浮劑 (FS) 對水稻作物安全性良好。

為了進一步降低單一藥劑對病原菌群體的選擇壓力，延緩抗藥性產生，本研究測定了氰烯菌酯和滅菌唑按照不同比例復配后對水稻惡苗病菌的聯合毒力。結果顯示，氰烯菌酯與滅菌唑在供試的7 種復配比例下對水稻惡苗病菌菌絲生長的抑制效果均表現為相加作用，故建議生產中可將滅菌唑與氰烯菌酯輪換或復配使用以協同防控水稻惡苗病，進一步延緩病原菌對單一藥劑抗藥性的發展，從而保障病害防效和水稻生產安全。