貴州省2013-2021年羊種布魯氏菌分離株的多位點可變數目串聯重復序列分析

王 月，譚勤琴,2，劉 英，楊幸貴,2，營 夏,2，馬 青，韋小瑜，李世軍

布魯氏菌(Brucella)是一類胞內寄生的革蘭陰性菌，主要引起人獸共患性布魯氏菌病(Brucellosis，簡稱布病)[1-2]。FAO/WHO依據布魯氏菌屬細菌的生化特性及宿主偏好性將其分為6個經典種，19個生物型。羊種、牛種和豬種布魯氏菌是人類感染布病的主要病原體[1]，貴州省布病疫情主要由羊種導致[3]。布魯氏菌病原體可通過體表粘膜、消化道、呼吸道侵入機體，而人感染布病的途徑通常與職業、飲食、生活習慣相關[1]。自2010年，“千萬只肉羊”工程在貴州省啟動，及后續“十二五規劃”提出的“著力打造一批規?；?、標準化、產業化的優質肉豬、肉羊、肉牛及地方特色畜禽生產基地，努力建設生態畜牧業大省”，使得我省養羊業獲得長足發展[4]。貴州省于2010年首次從貴州省山羊血液分離到羊種布魯氏菌[5]，到2015年，貴州省布病疫情已覆蓋貴陽、 黔南、黔東南、銅仁、遵義、黔西南、六盤水、安順和畢節9個市/州及貴安新區，僅部分縣未報道過布病疫情[6]，防控形勢嚴峻。

布魯氏菌種間同源性高[7]，表型分析無法對其進行關聯性研究，多位點可變數目串聯重復序列分析(Multiple locus variable-number tandem repeat analysis，MLVA)技術可克服這方面的缺陷，其分型數據可在MLVA數據庫進行網絡數據共享和分型鑒定，具有分辨率佳、重復性好、可比性高的特點[8-10]。MLVA分型技術基于非感染性核酸材料[11]，降低操作人員的感染風險，被廣泛用于分子流行病學調查及溯源分析[12-14]。本研究采用MLVA-16方法對貴州省78株羊種布魯氏菌本地株進行分子分型分析，以期發現貴州省羊種布魯氏菌間的關聯性，為貴州省布病疫情的科學防控提供可靠的依據。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 貴州省疾病預防控制中心布病實驗室分離、鑒定及保存的羊種布魯氏菌菌株(2013-2021年)，總計78株。

1.2 主要儀器與試劑 主要儀器有PCR擴增儀(美國Thermo)、凝膠成像儀(美國Bio-Rad)等。主要試劑有布魯氏菌瓊脂培養基(美國BD)、引物及配套PCR試劑(北京天一輝遠生物科技有限公司)。

1.3 細菌培養及DNA提取 將實驗室保存菌株嚴格按照《2019布魯氏菌病診斷標準(WS269-2019)》的操作程序接種于布魯氏菌瓊脂平板上，置37 ℃ CO2培養箱，根據細菌的生長情況培養24～48 h。挑取布魯氏菌菌落研磨制成菌懸液，經煮沸法提取菌株核酸[3]，同時提取疫苗株M5、A19、S2的核酸作試驗用陽性對照。

1.4 布魯氏菌的復判 用布魯氏菌屬特異性基因BCSP-31[15]對菌株進行鑒定，疫苗株M5、A19及S2 核酸作陽性對照，純水為陰性對照。依據文獻[16]使用的B4和B5引物序列及擴增參數進行擴增，產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 布魯氏菌株種型的復判 采用基于布魯氏菌屬特異性插入序列IS711[17]建立的多重PCR技術對78株分離菌進行種/型鑒定[18]，疫苗株M5、A19及S2核酸作陽性對照，純水作陰性對照。依據文獻[19]使用的引物序列和擴增參數進行擴增，產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 布魯氏菌株MLVA-16分型 78株布魯氏菌株根據文獻[20]使用的16個位點引物及擴增參數擴增。MLVA-16包括panel 1、panel 2A和panel 2B，共16個位點，MLVA-8即panel 1的所有8個位點，用于布魯氏菌種的分析。Panel 1(06、08、11、12、42、43、45及55 )各位點的擴增產物在實驗室內進行瓊脂凝膠電泳，挑取差異序列送北京天一輝遠生物科技有限公司進行測序。對測得序列進行整理，去除側翼序列得到該位點的串聯重復序列，通過換算，得到該序列的重復串聯數值。Panel 2包括 panel 2A(18、 19、21)和panel 2B(04、07、09、16、30)，各位點采用FAM基團標記引物進行擴增，產物送公司進行毛細管電泳，結果參照Panel 2各位點重復單元長度及重復數目換算表得到重復數值。

1.7 MLVA基因型分析 將MLVA基因型數值輸入MLVAbank(http//mcrobes genotyping.i2bc.paris-saclay.fr/)數據庫進行比對確定其MLVA-8的基因型。用 BioNumerics (Version 8.0)軟件對78株羊種菌分離株MLVA基因型進行聚類分析，聚類方式用非加權組平均法 (UPGMA)，構建聚類分析樹狀圖和最小生成樹(Minimum spanning tree，MST)。

2 結 果

2.1 BCSP31-PCR的復判結果 除陰性對照外，78株菌株核酸及疫苗株核酸的的擴增產物均產生分子量約為223 bp的條帶，判為布魯氏菌屬細菌。

2.2 AMOS-PCR對布魯氏菌種/型的復判結果 78株本地分離株和M5的擴增產物均出現分子量約為731 bp和178 bp的條帶，鑒定為羊種布魯氏菌，陰性對照無特異條帶出現。

2.3 MLVA-8分型結果 78株羊種布魯氏菌基于MLVA-8分型被分為5種型(即42、43、45、58和1種未分類型)，以42、43型為主，二者占總數91.03%，見表1。42型在全省7個市/州均有分布，分布最廣。黔西南地區分布著4種MLVA-8基因型，多樣性較高，且出現一種新基因型(1-5-3-12-3-1-3-2)，見表2。

表1 78株羊種布魯氏菌的MLVA-8 基因型別及百分比Tab.1 MLVA-8 genotypes and percentages of 78 B. melitensis strains

表2 78株羊種布魯氏菌MLVA-8基因型的地區分布Tab.2 Regional distribution of MLVA-8 genotypes of the 78 B. melitensis strains

2.4 MLVA-16分型結果 78株羊種布魯氏菌基于MLVA-16分型數據構建聚類分析樹狀圖，分為4個群，46種MLVA-16基因型，單基因型分離株32株，余46株構成14種MLVA-16基因型(圖1)。 MLVA-16基因型的地區分布中，遵義市16種，黔東南州11種，該2地為貴州省MLVA-16基因型多樣性主要聚集地(表3)。78株羊種菌基于MLVA-16分型數據并以每個節點相同位點最大距離為1構建MST，78株分離株被分為8個遺傳復合體和14個單體，遵義與黔東南、黔南及畢節地區的菌株間均存在共享基因型，同一地區年份相近的菌株基因型之間的遺傳距離也很近(圖2)。

圖1 貴州省78株羊種布魯氏菌的MLVA-16聚類分析樹狀圖Fig.1 Dendrogram based on MLVA genotyping analysis (UPGMA method), showing the correlations among 78 B. melitensis strains

表3 78株羊種布魯氏菌MLVA-16基因型的地區分布Tab.3 Regional distribution of MLVA-16 genotypes of the 78 B. melitensis strains

圖2 貴州省78株羊種布魯氏菌MLVA基因型聚類分析的MST圖Fig.2 Clustering analysis MST (minimum spanning tree) mapping based on MLVA genotype data for 78 B. melitensis strains

3 討 論

貴州省布病疫情的擴大蔓延，是由于近年來貴州省養羊業迅猛發展，大量從省外引種[21]，加之養殖模式大多為散養和小規模養殖，散養戶對布病的認知及防治知識匱乏，自我保護技能欠缺，導致疫情形勢嚴峻[6]。

羊種布魯氏菌是貴州省布病疫情的主要病原體，本研究對2013-2021年間貴州省78株羊種菌進行MLVA基因分型，基于MLVA-8分型數據分為5種基因型(即42、43、45、58和1種未分類型)。42及43型占總數91.03%，屬省內羊種布魯氏菌優勢基因型，國內研究者研究證明該2種基因型也是國內布魯氏菌的優勢基因型[22-28]，證實貴州省羊種布魯氏菌流行株與國內流行株一致。貴州省羊種布魯氏菌已鑒定的MLVA-8基因型均屬于“東地中海型”，即其地理起源可能相同。黔西南地區布魯氏菌的分離株存在4種MLVA-8基因型，基因型多樣性較高，鑒于MLVA-16的panel 1模塊位點的變異度較低，提示該地可能存在多個布魯氏菌傳染源。黔南及黔西南鄰近云南及廣西2省，廣西、云南均鑒定出布魯氏菌58型[26,28]，在山西、青海均有布魯氏菌45型的分布[26-27]，基因型的一致性提示疫情病原菌間存在一定關聯性，可能為與鄰省間的畜牧貿易活動相關，故應加強畜牧貿易活動的監管，同時嚴格執行動物的檢驗檢疫。未明確分類的MLVA-8型(1-5-3-12-3-1-3-2)分離于2016年，此后未再檢出該基因型，提示布魯氏菌可能為適應不同的自然地理環境而改變了其基因型[29]。

基于MLVA-16分型數據，78株羊種菌分離株聚為4個基因群(A-D)，分為46種基因型，親緣關系較近(≥73.9)，單基因型菌株32株,余46株構成14種共享基因型，證實貴州省羊種布魯氏菌分離株MLVA基因型具有型別多樣性。MLVA-16基因型的地區分布中，遵義及黔東南州分布的基因型最多，提示這2地的布病疫情可能存在多個傳染源。MST圖顯示，相鄰時間段，相鄰地區流行的基因型遺傳距離較近，提示貴州省省內布病疫情流行株的基因型未發生較大改變，遵義與黔南、黔東南、畢節等地的布魯氏菌流行株間的共享基因型，從時間維度(遵義疫情早于其他地區疫情)及基因型角度，揭示布病疫情可能存在從遵義擴散導致的省內傳播。2015年之后，貴州南部(黔東南、黔南、黔西南)相繼出現聚集性布病疫情，其基因型與遵義疫情基因型間的遺傳距離較遠，而與臨省廣西、云南的MLVA-8基因型一致，提示可能為省外輸入性導致的聚集性布病疫情。

布魯氏菌的MLVA分型分析對于布病疫情判斷及防控具有重要意義，貴州省羊種布魯氏菌分離株經MLVA分析發現，貴州省布病疫情可能存在以遵義為中心的省內傳播及來自省外輸入傳播的多條傳播鏈。相關部門需要做好布病疫情的外防輸入，內防擴散，衛生疾控部門與動物防疫部門應加強聯防聯控，對于外防輸入，須嚴格加強對跨地區動物檢疫，對于內防擴散，加強疫情監測是相關部門需要關注的防控重點。

利益沖突：無