NLRP3及其抑制藥物在腎缺血/再灌注損傷中的研究進展

陳 濤，蔡 飛，江波濤

(1.湖北科技學院藥學院；2.咸寧市中心醫院/湖北科技學院附屬第一醫院藥學部;3.湖北科技學院糖尿病 心腦血管病變湖北省重點實驗室；4.咸寧市中心醫院/湖北科技學院附屬第一醫院泌尿外科，湖北 咸寧 437100)

腎缺血/再灌注損傷(renal ischemic reperfusion injury，RIRI)易發生于機體休克、腎臟移植、心肺復蘇等疾病，以腎功能下降為主，輕者可引起急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)，嚴重患者會進展為急性腎衰竭，目前尚無有效的預防措施和治療策略。RIRI的發病機制有：腎素-血管緊張素系統的激活、細胞內鈣離子超載、細胞的凋亡與自噬、機體氧化應激、微循環功能障礙和炎癥反應等。其中，炎癥反應是RIRI中研究較多的病理機制之一。

Nod樣受體蛋白3((Nod-1ike receptor protein 3，NLRP3)與多種腎臟性疾病的發病機制密切相關，包括糖尿病腎病、晶體相關性腎病、慢性腎病、AKI等。研究顯示[1-3]，NLRP3炎癥小體在RIRI的疾病進展中同樣扮演著重要角色。

1 NLRP3炎癥小體的結構及活化

NLRP3(又稱NALP3、冷凍蛋白、CIAS1、PYPAF1和CLR11)位于染色體1q44上，屬于NLR蛋白家族中NLRP(nod-like receptor protein)亞家族成員之一，它是一種大分子蛋白復合體，其組成成分包括NLRP3、凋亡相關微粒蛋白(apoptosisassociated speck-like protein，ASC)和天冬氨酸蛋白水解酶-1(cysteinyl aspartate-specific proteases-1，caspase-1)蛋白。當NLRP3激活后，其N-末端的效應結構域(Pyrin domain，PYD)識別并結合ASC的PYD，募集ASC和caspase-1的前體，從而形成NLRP3炎癥小體。

NLRP3炎癥小體的激活包括線粒體反應性氧化物[4]、胞內鉀離子外流[5]、自噬功能障礙[6]、溶酶體裂解[7]等。主要有兩種信號參與NLRP3炎癥小體的激活，一是NF-κB等轉錄因子，通過上調NLRP3炎癥小體形成基因的表達，并產生IL-18和IL-1β等前體[8]；二是通過NLRP3炎癥小體激活后，募集相應的炎癥因子，生成活化的caspase-1，從而使IL-18、IL-1β等的前體剪切成熟[9-10]。最終NLRP3炎癥小體通過識別并結合內源性(如尿酸鹽結晶、細胞外三磷酸腺苷、膽固醇晶體、脂肪酸等)或外源性(如生物納米材料、淀粉樣沉淀、石棉等)損傷相關分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)[11]而完成自身的組裝活化，介導無菌炎癥。

2 NLRP3與腎缺血/再灌注損傷(RIRI)

2.1 NLRP3參與RIRI的機制在腎缺血/再灌注(renal ischemic reperfusion，RIR)過程中，隨著腎小管上皮細胞的損傷和壞死，會產生大量內源性的DAMPs，如高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1 protein，HMGB1)、ATP、線粒體活性氧(eROS)和熱休克蛋白等，從而激活NLRP3，導致腎小管壞死。

以往研究認為,NLRP3主要由免疫細胞表達，但在RIRI中卻有兩種細胞參與NLRP3的表達，分別是免疫細胞和腎細胞。Bakker等[3]的研究顯示，免疫細胞表達的NLRP3可導致腎小管上皮細胞凋亡、壞死，且腎小管上皮細胞的病變程度與免疫細胞表達的NLRP3數量正相關；而腎細胞表達的NLRP3則影響腎小管上皮細胞的修復，這種影響主要表現為阻礙腎小管上皮細胞修復?？梢姛o論是在減少腎小管上皮細胞損傷還是促進修復的過程中，NLRP3始終扮演著消極的角色。

盡管已經明確參與RIRI疾病進展的NLRP3有免疫細胞源性和腎細胞源性，但具體發病機制尚不完全清楚，目前認為主要是通過炎癥小體依賴途徑和非炎癥小體依賴途徑進行的。

Iyer等[1]通過研究野生型(WT)小鼠、NLRP3-/-小鼠和ASC-/-小鼠在發生RIRI后腎小管的壞死程度，發現無明顯差異。存在顯著差異的是腎間質中中性粒細胞的浸潤情況和腎功能，其中腎間質中性粒細胞浸潤最明顯、腎損傷嚴重的是WT小鼠，而NLRP3-/-小鼠、ASC-/-小鼠相較WT小鼠均有所改善，但ASC-/-小鼠是在再灌注后的5 d觀察到改善，而NLRP3-/-小鼠在再灌注后的24h就觀察到這種差異。在致死性RIR后，NLRP3-/-小鼠與ASC-/-小鼠的存活率均有所提高，其中NLRP3-/-小鼠更明顯。這些差異顯示NLRP3在RIRI中很可能存在炎癥小體依賴和非炎癥小體依賴途徑。

隨后，Shigeoka等[2]也證實了NLRP3可以通過非炎癥小體依賴途徑發揮作用。通過比較WT小鼠和NLRP3-/-小鼠，發現在RIRI后，WT小鼠的腎小管壞死程度更重、腎功能損傷更明顯；且在NLRP3-/-小鼠中，檢測到IL-1β和IL-18明顯偏低。隨后對IL-1β-/-小鼠、IL-18-/-小鼠、ASC-/-小鼠及caspase-1-/-小鼠RIRI后的腎功能情況進行檢測，發現無明顯改善。IL-1β-/-小鼠和IL-18-/-小鼠的腎功能結果說明，NLRP3缺陷相關的腎臟保護作用獨立于炎癥小體介導的IL-1β和IL-18的釋放。

2.2 NLRP3在RIRI中的激活途徑

2.2.1P2X4和P2X7誘導NLRP3炎癥小體激活 Iyer等[1]發現RIRI后，隨著腎小管細胞壞死，線粒體釋放的ATP增多，大量的ATP可通過刺激P2X7受體來誘導NLRP3炎癥小體激活。Qian等[12]通過與WT小鼠對比研究發現，P2X7R(-/-)小鼠在RIRI后腎功能得到改善，且炎癥因子產生減少，NLRP3被抑制；在缺氧/復氧(H/R)的誘導下，發現急性腎損傷患者的近端腎小管上皮細胞(HK-2)的ATP釋放增多，而缺血所致的AKI，在消耗HK-2外ATP和使用P2X7受體拮抗劑后均可改善，且同時檢測到NLRP3炎癥小體被抑制。

有研究報道P2X4和P2X7[13]在氨基酸序列、生理學通道、染色體位置和組織分布等方面極其相似，存在異構共表達，因此Han等[14]推測NLRP3炎癥小體也可被P2X4受體誘導激活。通過比較P2X4WT小鼠和P2X4KO小鼠，發現P2X4KO小鼠對RIRI所致的AKI保護作用明顯，可使腎小管壞死程度減輕，炎癥反應和NLRP3炎癥小體信號顯著減弱；而在使用了P2X4激動劑TPγS后，P2X4WT小鼠的近端腎小管細胞中NLRP3炎癥小體的信號明顯增強。因此，NLRP3炎癥小體可被P2X4受體和P2X7受體誘導激活，但是否都通過ATP-P2X4/P2X7-NLRP3途徑，有待進一步研究。

2.2.2通過ROS-TXNIP-NLRP3途徑激活NLRP3炎癥小體 Xiao等[15]發現糖尿病大鼠RIRI后NLRP3炎癥小體的激活是由硫氧還原蛋白-相互作用蛋白(thioredoxin interacting protein，TXNIP)介導并依賴于活性氧(ROS)。

Wen等[16]的研究驗證了該結論，在缺血/再灌注損傷(SIRI)誘導的HK-2中，發現TXNIP的表達、TXNIP和線粒體的共定位均增強。而使用線粒體靶向抗氧化劑MitoTempo處理HK-2后，發現線粒體膜電位(MMP)的下降，mROS的產生減少，與此同時NLRP3炎癥小體和TXNIP的激活和共定位均被抑制，而NLRP3炎癥小體在TXNIP siRNA轉染的HK-2中是明顯被抑制的。這些結果提示，ROS-TXNIP-NLRP3途徑可激活NLRP3炎癥小體。

2.2.3CTSB和CTSL可促進NLRP3炎癥小體的激活 Tang等[17]發現組織蛋白酶B(CTSB)和組織蛋白酶L(CTSL)可促進體內NLRP3炎癥小體的激活，從而加劇RIRI。研究發現在H/R誘導的HK-2的上清液中，CTSB和CTSL的缺失可使caspase-1和IL-1β的表達明顯抑制；將CTSB及CTSL siRNA在體外轉染入H/R誘導的HK-2中，發現由于siRNA轉染降低了mRNA水平和CTS的活性，IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1等蛋白的表達也相應下調，因此推測CTSB和CTSL能夠誘導NLRP3炎癥小體的激活。在使用CTSB特異性抑制劑Ca074Me對小鼠進行預處理，發現血清肌酐和腎臟組織病理學變化顯著減弱，證實了CTSB可有效減輕RIRI。由于Ca074Me對酶的抑制與劑量相關，在高劑量下可抑制多種組織蛋白酶[18-19]，因此實驗還選用1 μmol·L-1Ca074Me(CTSB抑制劑)和15 μmol·L-1Ca074Me(CTSB與CTSL抑制劑)對H/R誘導的HK-2進行預處理，發現CTSB和CTSL的活性顯著降低，腎臟NLRP3、ASC、caspase-1和IL-1β的表達也減弱。該研究表明，CTSB和CTSL可促進NLRP3炎癥小體的激活，阻斷CTSB和CTSL可減輕RIRI。

2.2.4通過激活Nrf2來抑制NLRP3炎癥小體的激活 Liu等[20]已證實，激活Nrf2可抑制TXNIP-TRX1復合物的解離，從而阻止TXNIP激活NLRP3蛋白。Pang等[21]研究也發現,激活Nrf2/NLRP3信號通路可抑制caspase-1/焦亡相關蛋白gasdermin D(GSDMD)介導的細胞焦亡，從而減輕RIRI。

2.3 RIRI中抑制NLRP3激活的藥物

2.3.1羥氯喹 Tang等[17]在RIR手術前1周，使用羥氯喹(10 mg·kg-1·d-1)連續灌胃雄性小鼠，發現羥氯喹可通過下調RIR小鼠的NF-κB信號從而抑制NLRP3炎癥小體的激活。

2.3.2右美托咪定 Kim等[22]分別在腎缺血前1 h和再灌注后給予雄性糖尿病大鼠右美托咪定(10 μg·kg-1)，發現由RIRI所致的NLRP3、caspase-1、IL-1β、phospho-AKT和phospho-ERK等上調信號，均被減弱；但再灌注后使用右美托咪定在調節NLRP3、phospho-AKT和phospho-ERK等信號傳導以及氧化應激方面明顯優于缺血前給藥。

2.3.3多酚酸鹽B Pang等[21]在RIR手術前1周，分別給予雄性小鼠高(200 mg·kg-1·d-1)、中(100 mg·kg-1·d-1)和低(50 mg·kg-1·d-1)劑量的多酚酸鹽B，發現3組藥物均可減輕RIRI所致的AKI，其中高劑量組效果最顯著。機制研究發現多酚酸鹽B可直接激活Nrf2的核表達，抑制RIR時機體的氧化應激反應、NLRP3炎癥小體的激活、促炎因子釋放以及細胞焦亡。

2.3.4促紅細胞生成素 Kwak等[23]在雄性小鼠雙側腎動脈閉塞前30 min和再灌注前5 min分別給予促紅細胞生成素(500 IU·kg-1)1次，發現給予促紅細胞生成素的RIR小鼠的細胞凋亡減少，氧化應激反應降低，巨噬細胞浸潤減少，ICAM-1和MCP-1的表達被抑制。研究證實，促紅細胞生成素可通過激活COX-2和NF-κB信號通路來下調NLRP3、caspase-1和NLRP1等的表達。

2.3.5紫花前胡苷 Liao等[24]在RIR手術前用紫花前胡苷(20 mg·kg-1·d-1)連續灌胃雄性小鼠3 d，結果發現紫花前胡苷預處理組的肌酐和尿素氮較RIR組明顯下降，腎小管損傷程度顯著減輕。經H/R誘導的HK-2在使用紫花前胡苷處理后，TNF-α、IL-1β和IL-6的表達明顯抑制，并且紫花前胡苷還能抑制ROS及NLPR3炎癥小體的激活。

2.4 RIRI中抑制NLRP3激活的化合物

2.4.1白藜蘆醇 Xiao等[15]在給雄性糖尿病大鼠連續灌胃白藜蘆醇(10 mg·kg-1·d-1)7 d后行RIR手術，發現白藜蘆醇能抑制糖尿病大鼠RIRI后TXNIP與NLRP3的結合，以及caspase-1、IL-1和IL-18的表達。

2.4.2表氧化二十碳三烯酸 朱曄等[25]在RIR手術前1 h，分別給雄性小鼠注射表氧化二十碳三烯酸(2 mg·kg-1)、TLR4抑制劑TAK242(3 mg·kg-1)各1次，發現表氧化二十碳三烯酸能夠減輕小鼠RIR所致的腎功能損傷和炎癥反應。該保護作用可能與抑制TLR4通路有關，該通路可抑制NLRP3活化并介導細胞焦亡。

2.4.3A68930 Cao等[26]在RIR后，給雄性小鼠注射3次A68930(5 mg·kg-1)，發現A68930能激活D-1多巴胺受體，抑制NLRP3炎癥小體的激活，減輕腎臟和系統炎癥，改善RIR所致的腎功能異常。

2.4.4白頭翁皂苷B4 李俊等[27]使用低(1.25 mg·kg-1·d-1)、中(2.5 mg·kg-1·d-1)、高(5 mg·kg-1·d-1)劑量的白頭翁皂苷B4對RIR后的雄性大鼠，連續治療5 d，發現大鼠RIRI減輕，其中高劑量組最明顯。其研究表明，抑制炎癥是RIRI治療的關鍵，可通過抑制NLRP3信號通路及TLR4/NF-κB信號通路來實現。

2.4.5四甲基吡嗪 Sun等[28]于RIR后立即給雄性大鼠腹腔注射鹽酸四甲基吡嗪(40 mg·kg-1，間隔6 h)，發現與RIR組比，鹽酸四甲基吡嗪組血清肌酐、血尿素氮、TNF-α、IL-6等水平均較低，腎組織NLRP3表達下調。經H/R誘導的HK-2在使用鹽酸四甲基吡嗪后，HIF-1α和NLRP3的表達均被下調。

2.4.6Mcc950 Zou等[29]在腎移植后使用MCC950(50 mg·kg-1，每周2次)對雄性大鼠進行治療，發現MCC950可通過NLRP3-IL-1β趨化因子軸對腎移植產生保護作用。武康[30]在腎缺血前15 min，通過鼠尾靜脈給雄性小鼠注射MCC950(3 mg·kg-1)，發現與RIR組相比，接受MCC950治療的小鼠，腎功能顯著改善，腎組織損傷程度減輕，NLRP3、IL-1β和caspase-1的表達被抑制。

3 NLRP3在RIRI研究中的總結與展望

綜上，NLRP3可作用于RIRI的多個環節，包括炎癥反應、腎小管上皮細胞的凋亡和修復等。研究NLRP3參與RIRI的發病機制及激活途徑，有助于闡明RIRI的病理過程，并針對性的進行干預，是RIRI預防和治療的關鍵。目前雖有部分研究，但以炎癥小體依賴途徑為主，非炎癥小體依賴途徑的研究甚少。而這兩種途徑又均可加劇RIRI ，因此后期需對非炎癥小體依賴途徑進行更深入的研究。近些年RIRI的發病機制還聚焦于自噬、細胞凋亡和壞死等，這些也為RIRI的預防和治療提供了新思路。

多種藥物或化合物通過抑制NLRP3的激活來減輕RIRI方面，相關文獻報道以動物研究為主，尚無臨床使用研究。但動物模型與人RIRI在發病機制、臨床表現等都相似，通過動物模型可有助于篩選出較理想的藥物或化合物，對尋找安全有效的RIRI治療方案十分重要；且目前的動物模型治療效果均較顯著，后期以進一步的臨床試驗結果做支撐，NLRP3非常有望成為治療RIRI的新靶點。