Aurora激酶A調控卵母細胞減數分裂的分子機制

劉 鳳，姚 波，莫曉龍，柳瓊友，任艷萍

遵義醫科大學基礎醫學院組織胚胎學教研室，貴州遵義 563000

Aurora激酶(aurora kinase，AURK)是廣泛分布在真核生物體內、進化高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，包括AURKA、AURKB和AURKC 3種亞型，其中，AURKA參與有絲分裂進入、中心體成熟和分離、雙極紡錘體組裝和穩定、染色體的濃集和中板的聚合以及染色體的正確分離[1- 2]。有文獻指出，AURKA在減數分裂過程中發揮的作用與有絲分裂類似[3]，但其具體作用機制以及其與有絲分裂的異同尚不清楚。因此本文將從AURKA在卵母細胞減數分裂中定位與活化，及其在調控紡錘體形成、紡錘體組裝檢查點(spindle assembly checkpoint，SAC)活化以及動粒-微管附著糾錯這幾個方面，探討AURKA在卵母細胞紡錘體組裝和染色體分離中的作用機制。

AURKA在有絲分裂和卵母細胞減數分裂中定位的異同

在體細胞中，AURKA的信使RNA及蛋白水平在G1期最低，S期逐漸升高，G2/M期增至最高，M期結束后迅速下降，表明其表達呈現周期依賴性[4- 5]。在有絲分裂過程中，AURKA于S晚期定位于復制的中心體，阻止中心體的再次復制，促進中心體的成熟與分離；G2期隨著復制的中心體移向細胞兩極；有絲分裂前期，隨著核膜破裂，AURKA在中心體及其附近微管上快速增加并調控紡錘體的形成和染色體分離；直到后期，隨著染色體分離，AURKA定位在紡錘體兩極，也定位在紡錘體中間區域，參與中央紡錘體的組裝[6]；有絲分裂結束并退出時，AURKA分布于子細胞核附近[7]。

研究發現，AURKA蛋白在小鼠卵母細胞中高表達，其表達量在生發泡(germinal vesicle，GV)期和第2次減數分裂中期(MⅡ期)卵母細胞中較高，在其他減數分裂成熟階段保持穩定[8]。在卵母細胞成熟過程中，AURKA在不同階段的定位不同。GV期，AURKA主要富集在染色體周圍，均勻分布在生發泡中[9]；生發泡破裂(germinal vesicle breakdown，GVBD)期，AURKA凝聚在染色質周圍；第1次減數分裂前中期(pre-MI)和第1次減數分裂中期(MI期)，AURKA定位于紡錘體兩極，調控紡錘體微管動力學和染色體排列[10]；從第1次減數分裂后期(AI期)到第1次減數分裂末期(Tel I期)，AURKA隨著姐妹染色單體分離而逐漸向兩極移動；到MII期，AURKA則在排出的第一極體及卵母細胞紡錘體上均有富集[11]。

由上可知，在有絲分裂和卵母細胞減數分裂早期和中期，AURKA均在紡錘體兩極有定位，表明在上述時期，AURKA在卵母細胞紡錘體兩極處可能發揮與有絲分裂紡錘體兩極處類似的功能。然而在卵母細胞的兩次減數分裂后期，AURKA仍僅定位于紡錘體兩極，這與在有絲分裂后期，AURKA定位于紡錘體兩極以及赤道板中間區域有所不同。該現象預示著AURKA在有絲分裂和減數分裂后期中的功能可能有所差別。

AURKA的活化

有絲分裂紡錘體組裝很大程度上依賴中心體，在核膜破裂時，中心體生成的微管被姐妹染色體的動粒捕捉，形成雙極紡錘體。AURKA調控紡錘體的組裝已在果蠅[12]、線蟲[13]和非洲爪蟾卵提取物[14]中得到證實。研究已經證明，AURKA通過作用于Ran GTPase信號通路的下游，參與有絲分裂中的紡錘體組裝[14- 15]。Ran GTPase通過從importion α/β中釋放爪蟾類驅動蛋白靶向蛋白2(targeting protein for Xenopus kinesin-like protein 2，TPX2)，與AURKA結合，致使AURKA發生自身磷酸化，進而被激活[16]。TPX2 RNAi介導的AURKA失活可破壞有絲分裂雙極紡錘體的組裝[17]。因此，Ran GTPase介導的TPX2激活AURKA對于有絲分裂紡錘體形成至關重要。

在卵母細胞中，紡錘體形成依賴于微管組織中心的自我組裝。GVBD期，微管組織中心(microtubule organizing centres，MTOCs)中Ran GTPase大量增加，與有絲分裂相同，卵母細胞中Ran GTPase同樣具有釋放TPX2的功能[18]。敲除TPX2會導致AURKA在紡錘體極處的定位信號消失，紡錘體形態出現異常，如無紡錘體、單極紡錘體、紡錘體過度拉長或紡錘體組裝異常等等[19- 20]。在小鼠[21]和線蟲[13]卵母細胞中，通過抑制AURKA活性導致紡錘體形態出現同樣異常表型。以上實驗結果表明，在卵母細胞減數分裂中，Ran GTPase同樣通過介導TPX2的釋放，激活MTOCs上AURKA激酶活性，以此調控紡錘體的裝配[22]。

除了TPX2之外，Bora也可以激活AURKA。在有絲分裂中，AURKA可與Bora相互作用，而發生磷酸化，激活AURKA活性[23]。Hutterer等[24]研究發現，Bora突變可導致AURKA活性減弱，且Bora可激活被蛋白磷酸酶1失活的AURKA。過量表達Bora可以挽救突變造成的AURKA活性下降、染色體定位缺陷和中心體成熟缺陷，但若AURKA突變導致其活性完全喪失，則不能被過量表達的Bora挽救突變造成的后果。以上結果表明，在有絲分裂中Bora是AURKA的激活劑。在卵母細胞中，抗體抑制Bora可導致AURKA在紡錘體的定位消失，紡錘體形成缺陷和染色體排列不齊，致使卵母細胞停滯在pre-MI/MI期[25]。Bora的基因敲除引起的AURKA活性減弱，致使有絲分裂中期停滯延長，同源染色體分離推遲[26]。因此，在卵母細胞減數分裂過程中Bora也是AURKA活化所需的。

因此，在卵母細胞中，Ran GTPase通過釋放TPX2介導AURKA的活化；此外，AURKA活化也需要Bora。這與體細胞有絲分裂中AURKA活化的分子機制基本相同。

AURKA調控紡錘體組裝

在體細胞中，紡錘體組裝很大程度上依賴于中心體成核，在中心體具備成核能力前，需要經歷一個成熟階段。在這一成熟過程中，AURKA通過招募大量γ-微管環形復合物(γ-tubulin ring complex，γ-TuRC)和中心粒周圍物質(pericentriolar material，PCM)到中心體上，促使中心體成熟與分離[27]。抑制AURKA導致中心體成熟與分離缺陷，形成單極紡錘體[28]。AURKA的具體調控機制為：AURKA通過招募一個高度保守的轉化型酸性螺旋卷曲蛋白家族(transforming acidic coiled-coil proteins，TACC)到中心體，TACC與高度保守的微管聚合酶XMAP215(ch-TOG/XMAP215)的蛋白家族成員相互作用，將ch-TOG/XMAP215裝載到紡錘體微管，以此對抗有絲分裂著絲粒相關驅動蛋白(mitotic centromere-associated kinesin,MCAK)和非洲瓜蟾驅動蛋白突變調節劑- 1(xenopus kinesin catastrophe modulator- 1，XKCM1)的作用[29]，最終形成穩定的中心體微管。與此同時，AURKA也可以直接磷酸化MCAK來影響雙極紡錘體形成[30]。因此，在有絲分裂中AURKA可調控中心體紡錘體組裝。

在大多數雌性哺乳動物卵母細胞中無中心粒，其紡錘體的形成不同于體細胞的有絲分裂進程。卵母細胞紡錘體組裝依賴于凝聚染色體周圍的微管自發成核，形成多個微管組織中心，在功能上取代中心體完成紡錘體組裝[31]。在卵母細胞紡錘體組裝過程中，多個MTOCs先破碎成大量的小MTOCs碎片，然后再合并成兩個相等的紡錘體極[32]。MTOCs雖然無中心粒，但含有中心粒周圍物質成分，包括γ-微管(γ-tubulin)和中心粒周蛋白(pericentrin，PCNT)[9]。在卵母細胞中，AURKA與MTOCs主要蛋白γ-微管[33]和PCNT[34]共定位于紡錘體兩極，提示AURKA可能與MTOCs調控紡錘體組裝相關。進一步研究發現，AURKA是一個關鍵的MTOCs相關成分，整個減數分裂期間AURKA與MTOCs共定位，在長時間的卵母細胞減數分裂前期停滯恢復后，AURKA通過招募γ-微管和PCNT觸發微管成核[35- 36]，驅動MTOCs介導紡錘體組裝[37]。抑制劑抑制AURKA導致MTOCs的大小和數量減少，微管成核的啟動延遲[9]?；蚯贸鼳URKA，小鼠卵母細胞中γ-微管與中心蛋白的共定位信號消失，集聚的MTOCs分離[11，38]。Ding等[8]實驗證實，在MI卵母細胞中，小干擾RNA干擾AURKA導致MTOCs在兩極的定位發生紊亂，分散于紡錘體周圍區域。以上實驗結果表明，在卵母細胞減數分裂過程中，AURKA是MTOCs介導紡錘體形成所必需的。

由上可知，雖然在有絲分裂和卵母細胞減數分裂紡錘體形成過程中，二者的紡錘體極分別通過中心體和MTOCs介導成核，成核的途徑和過程有所不同，但二者的成核過程均離不開AURKA的參與。有絲分裂過程中，AURKA通過TACC-ch-TOG/XMAP215途徑，招募γ-微管和PCNT，介導中心體成核；在卵母細胞減數分裂過程中，AURKA同樣可以招募γ-微管和PCNT，介導MTOCs成核。但在卵母細胞減數分裂過程中，AURKA是通過何種途徑招募γ-微管和PCNT尚不可知。

AURKA維持紡錘體組裝檢查點活性

動粒-微管的精確附著是調控染色體正確分離的關鍵，SAC是一種監視機制，在雙極紡錘體組裝過程中監控動粒與微管附著[39]。在體細胞動粒-微管正確附著前，SAC抑制后期促進復合物/環體(anaphase-promoting complex/cyclosome，APC/C)活性，致使分離酶被保全素(securin)抑制，染色體無法分離，SAC將細胞阻滯在中期。一旦所有的動粒均連接到微管上，SAC沉默，紡錘體檢查點上的有絲分裂阻滯缺陷蛋白2(mitotic arrest-deficie protein 2，MAD2)對細胞周期蛋白20(cell division cycle 20，Cdc20)的抑制被解除，Cdc20結合并激活APC/C，活化的APC/C泛素化降解細胞周期蛋白B(cyclin B)和保全素。失去保全素的抑制作用，水解酶觸發染色體發生分離，細胞進入后期[40- 41]。人類體細胞中，SAC信號的有絲分裂檢查點復合體由MAD2、BubR1、Bub3、Cdc20蛋白組成，MAD2存在于未與微管發生附著的動粒上[42]。已有研究表明，在pre-MI期，活化的AURKA維持MAD2處于非附著動粒以及維持SAC的功能正常。抑制AURKA導致MAD2從動粒上移除，SAC失活，致使姐妹染色單體過早分離，產生非整倍體[43]。在人腫瘤細胞中使用AURKA特異性抑制劑MLN8045抑制AURKA活性，導致部分紡錘體極中心體缺失、染色體排列紊亂、后期染色體遲滯以及染色體非整倍率上升[44]。

在卵母細胞減數分裂進程中，MAD2位于pre-MI期卵母細胞的著絲粒上，一旦卵母細胞進入MI期，所有染色體排列在紡錘體赤道板處，MAD2在著絲粒上的信號消失[45- 46]。在動粒-微管正確附著前，AURKA通過招募MAD2到卵母細胞動粒上，發揮防止APC/C活化、維持SAC活性的作用。抑制AURKA導致MAD2提前從動粒區域移除[47]，染色體過早進入后期，表明抑制AURKA會擾亂MAD2的定位，進而導致SAC失活[48- 49]。

由上可知，在有絲分裂和卵母細胞減數分裂中，AURKA均是保持SAC活性、調控染色體正確分離所必須的，其功能異?？蓪е陆忝萌旧珕误w過早分離，染色體非整倍率上升。

AURKA調控動粒-微管正確附著

動粒-微管的精確連接是調控染色體正確分離的關鍵。染色體準確分離依賴于動粒-微管之間的核分裂周期蛋白80 (nuclear division cycle 80，NDC80)復合體[50]。NDC80復合體的主要成分動粒蛋白Hec1是AURKA的靶因子之一，也是產生穩定的動粒-微管附著的主要動粒蛋白。在有絲分裂中，當錯誤的動粒-微管附著體靠近紡錘體極時，AURKA通過磷酸化染色體上的Hec1來破壞附著體的穩定性[51]。而抑制AURKA活性后，錯誤附著體在近紡錘體極區域仍可保持穩定，致使染色體分離錯誤率上升，這表明AURKA在體細胞紡錘體極附近有較高的活性，可以破壞錯誤附著體的穩定性，以確保染色體的準確分離[47]。

Cairo等[52]研究發現，AURKA在卵母細胞中也有類似的功能。前期至前中期，紡錘體極附近AURKA選擇性地高水平磷酸化錯誤附著體Hec1，以破壞錯誤附著體的穩定性；在中期，AURKA維持低水平且持續的磷酸化水平，既有利于正確的動粒-微管附著的穩定性，也有利于染色體整齊地排列在赤道板上[53]。研究發現，AURKA在中期介導的動粒底物磷酸化至少有兩種機制：一種是內著絲粒蛋白(inner centromere protein，INCENP)招募AURKA到著絲粒區域，進而磷酸化Hec1，破壞錯誤附著體的穩定性，這不依賴染色體到紡錘體極的距離[53]。另一種是錯誤附著體染色體對的動粒缺乏張力[54]，并被拉向其中一個紡錘極附近，隨后被該區域的AURKA磷酸化，破壞其穩定性[51]。與有絲分裂相類似，在卵母細胞減數分裂后期，AURKA也開始降解，這樣既有利于形成穩定的動粒-微管連接來驅動染色體分離，又有利于防止正確的動粒-微管附著體在后期接近紡錘體極時被破壞[55]。

由上可知，在有絲分裂和減數分裂進程中，位于紡錘體極處的AURKA均可選擇性地破壞動粒-微管錯誤附著體，以允許形成新的附著體，確保中期染色體動粒-微管的正確附著，驅使染色體整齊地排列在赤道板上。AURKA功能異常均可導致動粒-微管錯誤附著致使染色體分離錯誤以及產生非整倍體卵母細胞。

總結與展望

本文從AURKA在體細胞有絲分裂和卵母細胞減數分裂中的細胞定位、活化機制以及在調控紡錘體形成、SAC活化、動粒-微管附著糾錯中的作用方面展開綜述，發現AURKA在體細胞有絲分裂和卵母細胞減數分裂進程中的作用基本相同，如均定位于紡錘體兩極，均可被TPX2以及Bora激活，均可介導紡錘體極的成核、SAC活化以及動粒-微管附著糾錯。但與有絲分裂AURKA參與紡錘體組裝調控機制方面的研究相比，卵母細胞減數分裂進程中AURKA的作用機制仍不夠透徹，如在有絲分裂過程中，AURKA通過TACC-ch-TOG/XMAP215途徑，招募γ-微管和PCNT，介導中心體成核。然而在卵母細胞減數分裂過程中，AURKA是通過何種途徑招募γ-微管和PCNT介導MTOCs成核的尚不可知。此外，在有絲分裂后期，AURKA在赤道板中間區有定位信號，而類似的信號并未在卵母細胞的兩次減數分裂后期出現，這表明，在有絲分裂和卵母細胞減數分裂之間AURKA的功能并不完全相同，AURKA在卵母細胞減數分裂后期赤道板中間區的作用可能被其他因子所替代，具體機制仍需進一步研究。在此基礎上，近年來一些學者開始對AURKs家族中AURKB和AURKC的功能產生興趣并開展研究，但兩者的功能尚未被系統闡明。以上問題均有待于進一步研究，以揭示細胞分裂調控機制，并為癌癥和生殖等相關臨床研究奠定理論基礎。