外泌體在毛乳頭細胞誘導毛發再生中的作用 ①

曹貴媛，祝寧俠

(桂林醫學院，廣西 桂林 541199)

隨著生活方式的改變和工作壓力的增加，脫發性疾病在人群中發病率逐漸升高，缺乏高效治療手段，嚴重影響患者形象和生理健康，降低生活質量。毛囊是活性微小型器官，由間質和上皮成分構成，其生長周期分為生長期、退行期和休止期三個階段，各周期功能狀態與脫發性疾病的發生密切相關[1]。毛乳頭(dermal papilla，DP)細胞作為毛囊單位的主要間充質成分，在維持毛發生長和誘導毛囊再生中發揮重要調節作用[1]。雄激素性脫發(androgenic alopecia，AGA)是臨床上最常見的脫發病理類型，研究人員從AGA患者頭皮分離的DP細胞中檢測到高水平的雄激素受體，并認為DP細胞誘導功能丟失導致了AGA發生[2]。因而維持DP細胞誘導毛發再生功能，成為了治療脫發性疾病的關鍵。外泌體(exosomes)由各種細胞分泌，包含蛋白質、脂質和miRNA等物質，在細胞間通信中發揮重要的作用。近年來研究發現外泌體具有維持DP細胞毛發誘導能力，為脫發類疾病的研究提供了新的方向。本文通過對國內外文獻的整理，對DP細胞誘導維持毛發再生機制及幾種細胞來源的外泌體在毛發再生中的作用進行綜述，期望為脫發類疾病的實驗研究和臨床治療提供思路。

1 DP細胞結構和功能

在早期毛囊發育過程中，單層上皮細胞接收來自真皮細胞的“第一真皮信號”Wnt后，增厚、局部形成毛囊基板并誘導下方的真皮細胞聚集成團；隨后毛囊基板收到由Wnt5a介導的“第二真皮信號”Shh，誘導上皮細胞向下生長增殖，形成毛母質細胞。毛母質細胞在多次增殖的過程中逐漸包裹聚集細胞團，并向上生長、分化為毛干和內根鞘，毛母質細胞包裹的細胞團逐漸發育成成熟的毛乳頭[3]。DP細胞位于毛囊底部，其通過與毛囊干細胞相互作用，在胚胎時期中毛囊的形成以及出生后毛囊周期性生長過程中扮演重要角色，機制與Wnt等多種信號通路相關[3-4]。研究表明，DP細胞通過分泌miR-22-5p靶向調控Wnt信號通路關鍵因子LEF-1，抑制毛囊干細胞增殖和分化，阻滯毛囊周期[4]。研究者提取AGA患者“禿發區”和“非禿發區”DP細胞進行培養，發現“禿發區”DP細胞更早呈現衰老表型，丟失毛囊誘導功能[5]。目前，脫發治療方法主要有藥物和毛囊單位移植，存在副作用及供體有限等問題[6]。因此，維持或恢復DP細胞毛發誘導能力因子的探索成為脫發治療研究的關注點。

2 外泌體的生物特性及其功能

細胞主動釋放且具有膜結構的囊泡統稱為細胞外囊泡，基于大小和生物物理性質可進一步分為外泌體、凋亡小體和微囊泡等。研究表明，外泌體與細胞外囊泡在大小、膜定位等方面具有相似的生物物理特征[7]。在1893年，Pan等[8]在綿羊網織紅細胞中首次發現外泌體，其為一種直徑約30～150 nm的膜結合納米囊泡，密度為1.11～1.19 g/ml，典型標志物為CD9、CD63和CD81[9]。隨后，研究者發現此類細胞外囊泡并不是細胞廢棄物，它能夠將信號傳遞給其他細胞，從而進行細胞間交流[10]。外泌體形成早期表現為細胞膜內陷，將一些細胞外成分(蛋白質、miRNA和脂質等)包裹進胞內，形成早期內涵體；而后早期內涵體經高爾基體作用融合成晚期內涵體，最終形成含有腔內囊泡的細胞內多膜體；這些細胞內多膜體釋放到細胞外形成外泌體，被靶細胞吸收后通過物質交換或釋放胞內物質實現信息交流[10]。

大量聚焦外泌體的研究已經發現干細胞、脂肪細胞和腫瘤細胞等都可以釋放外泌體，對多種生理和疾病病理發展過程有重大影響[10]。人誘導多能干細胞衍生的神經元外泌體，能促進神經細胞增殖，影響軸突的形成和形態發生[11]。在2型糖尿病中，脂肪細胞來源的外泌體通過傳遞miRNA和蛋白質等，調節胰島素敏感性，改善2型糖尿病癥狀[12]。靶向神經退行性疾病的研究表明，外泌體可干預細胞內毒性蛋白質的累積，緩解阿爾茨海默癥相關癥狀[13]。由于外泌體包含各種物質，如miRNA、脂質和DNA片段等，對外泌體內容物的檢測可作為不同腫瘤細胞的早期診斷潛在的重要選擇[14]。Zeng等[15]的研究發現，結直腸癌細胞通過衍生的外泌體將腫瘤轉移促進因子miR-25-3P輸送至血管內皮細胞，增加血管通透性和血管生成，并結合臨床數據提出外泌體miR-25-3P的定量檢測能夠早期識別患者腫瘤轉移風險，從而進行預防性治療。

3 外泌體與DP細胞誘導功能

3.1 外泌體與Wnt信號通路

毛囊形成和周期性生長涉及到多種信號通路，如轉化生長因子-β(TGF-β)、Shh、Wnt等。有研究結果表明，Wnt信號能夠促進毛囊干細胞增殖，加速毛囊從休止期向生長期過渡[16]。事實上，目前已經明確Wnt/β-catenin在DP細胞誘導毛發再生的關鍵作用，其與DP細胞促進毛囊發育和周期性生長作用均密切相關[16]。在AGA脫發機制研究中，研究者利用雙氫睪酮(DHT)干預DP細胞，觀察到Wnt10b表達下調和Wnt通路抑制因子DKK1表達上調，激活糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)，磷酸化β-連環蛋白(β-catenin)，使Wnt通路失活，影響下游基因c-myc等的表達，導致DP細胞丟失毛囊誘導功能，并以旁分泌方式抑制毛囊干細胞分化[17]。鑒于Wnt信號通路與DP細胞誘導功能有緊密相關，研究者針對外泌體和Wnt信號通路進行了深入的探索。Gross等[18]闡述外泌體包含活性Wnt因子(Wnt5a和Wnt3a)，Stem Cells Dev雜志報告了CD63+外泌體通過運輸Wnt信號通路配體蛋白及mRNA進行細胞間信息交流，促進骨髓間充質干細胞刺激皮膚修復和再生進程[19]。在腫瘤微環境中，外泌體介導Wnt信號分子的轉移，調節Wnt信號通路活化，從而影響腫瘤細胞狀態，而間充質干細胞通過衍生的富含Wnt4a外泌體，激活Wnt/β-catenin信號通路，促進皮膚組織的修復和再生[20]。另外，Zhou等[21]在毛囊不同周期應用DP細胞衍生的外泌體，發現其通過激活Wnt信號通路，促進外根鞘細胞增殖和遷移，進一步證實了外泌體通過Wnt信號通路影響毛囊再生的潛在作用環路。

3.2 DP細胞與其衍生的外泌體

毛囊底部的DP細胞可以通過釋放多種因子，如Wnt信號通路相關因子、成纖維生長因子7(FGF7)和TGF-β等，以自分泌或旁分泌的作用方式促進毛囊上皮細胞增殖分化，調控間充質-上皮細胞相互作用，調節毛囊再生和周期[22]。DP細胞功能異常導致AGA發生，而外泌體與DP細胞誘導功能關鍵通路Wnt信號通路關聯密切，DP細胞來源外泌體在毛發生長中的作用是毛囊生物學的研究熱點。

低代細胞有毛囊誘導功能，隨著傳代，高代DP細胞(>6代)逐漸失去此功能。曹丹霞等[23]提取低代DP3細胞來源的外泌體培養高代DP8細胞，觀察到后者細胞生物學特性改善，能夠維持誘導毛發再生能力。在6周齡C57BL/6小鼠背部脫毛后，注射DP細胞衍生的外泌體(dermal papilla cell-derived exosomes，DPC-Exos)能夠促進外根鞘(ORS)細胞增殖和遷移，同時上調β-catenin和Shh的表達，加速毛囊休止期至生長期過渡[21]。Kwack等[24]應用7周齡雌性C57BL/6小鼠，背部皮膚脫毛后每周注射DP-Exos，周期為26 d，實驗結果與上述研究一致，進一步表明DPC-Exos在毛發生長過程中的重要作用。此外，有研究將間充質干細胞和DP細胞來源的外泌體毛發再生作用進行對比，發現DPC-Exos對TGF-β通路的激活，促進DP細胞增殖和毛發生長作用更明顯[25]。這些結果均顯示DP細胞可以分泌外泌體促進毛發生長，機制與Wnt等關鍵信號通路相關。

通常，獲取DP細胞來源的外泌體可以通過二維和三維培養細胞方式。研究者通過對比兩種培養方式，發現三維培養的DP球狀體能夠有效地誘導毛囊從休止期向生長期轉換，而DP球狀體衍生的外泌體miR-218-5p高水平表達，通過上調Wnt信號通路關鍵因子β-catenin的表達及下調Wnt信號通路抑制因子SFRP2，活化Wnt信號通路，加速毛囊從休止期進入生長期[26]。Chen等[27]發現三維培養DP球狀體釋放的DPC-Exos中miR-140-5p表達水平較高，可以抑制BMP信號通路，調控毛囊周期，由此推測球狀體培養的DPC-Exos促進毛發生長的作用更明顯。

3.3 間充質干細胞與其衍生的外泌體

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSC)存在于骨髓、臍帶血等器官間質中，可分化為多種間充質組織，如肌腱、脂肪骨髓基質、肌肉和軟骨等[28]。研究人員在骨髓和臍帶血中提取間充質干細胞，體外培養后形成自聚集的球狀毛乳頭樣組織，隨后注射裸鼠，6周后觀察到毛發長出[29]。Bak等[30]使用0.1%地塞米松局部用藥誘導毛發進入退化期，發現應用人臍帶血來源的間充質干細胞能通過下調Wnt通路抑制因子DKK1緩解局部使用地塞米松誘導的毛發退化進程，顯著促進DP細胞和角質形成細胞增殖，提示間充質細胞通過分泌某種因子的方式在皮膚附屬器再生中的重要作用。在深Ⅱ度大鼠皮膚燒傷模型中，人臍帶間充質干細胞衍生的外泌體“加速”Wnt/β-catenin信號促進1型和3型膠原的產生，加速傷口處皮膚的愈合，同時調節YAP信號的“剎車”抑制膠原蛋白的沉積，調控皮膚組織再生[20]。Rajendran等[31]用MSC衍生的細胞外囊泡處理DP細胞，發現DP細胞血管內皮生長因子(VEGF)和胰島素樣生長因子I(IGF-I)的mRNA表達水平上調，而MSC衍生的細胞外囊泡注射C57BL/6小鼠皮膚能夠誘導小鼠背部毛發出現再生，顯示MSC衍生出的細胞外囊泡具有激活DP細胞，促進DP細胞增殖，發揮促進毛囊從休止期向生長期進行轉化的作用。上述結果顯示，MSC衍生的外泌體類細胞外囊泡能夠調控DP細胞的毛囊的誘導能力，促進毛發再生。

3.4 其他細胞衍生的外泌體

隨著外泌體的研究深度和廣度的增加，研究者發現外泌體的應用有益于解決條件介質中生長因子和細胞因子半衰期短的問題。如將脂肪來源的干細胞中分離出的外泌體加入DP細胞中，熒光顯微鏡下觀察到外泌體能夠進入DP細胞的胞質和核周，促進DP細胞的增殖和遷移能力，上調DP細胞誘導活性標志物堿性磷酸酶(ALP)的表達水平[32]。為了探究毛囊外根鞘細胞和血小板裂解液來源的外泌體能否維持DP細胞誘導毛囊的能力，研究人員進行外泌體的形態和DP細胞對外根鞘細胞和血小板裂解物外泌體攝取等系列實驗，發現外根鞘細胞外泌體能夠維持DP細胞傳代后的毛囊誘導能力[33]。同樣，人真皮成纖維細胞衍生的外泌體也能夠促進DP細胞增殖，并激活DP細胞中Wnt/β-catenin配體的分泌，從而活化Wnt信號傳導，影響毛發生長[34]。此外，從人角質形成細胞條件培養液中分離出外泌體加入到黑素細胞中進行培養，能夠上調黑素細胞相關蛋白的表達，調節黑素細胞色素化能力，調控皮膚再生[35]。

4 結語

在脫發類疾病中，市面上暫且缺乏安全高效的治療手段。藥物非那雄胺和米諾地爾等能在一定程度上改善脫發癥狀，但需要長期服用，存在明顯的不良反應。除了藥物治療，毛囊移植手術在臨床上也較為常用，通過將患者健康毛囊單位移植至禿發區，改善患者脫發外觀和自信心，但費用較高且自體毛囊供體短缺。在這種背景下，具有毛囊誘導功能的DP細胞成為脫發類疾病細胞療法的“明星”種子選手，但體外培養的DP細胞容易發生衰老失去誘導功能，成為限制其臨床應用的主要障礙。因而，靶向維持DP細胞誘導功能各種因子的研究成為毛發領域的研究焦點。外泌體能夠促進細胞增殖、遷移和血管生成，加速組織修復和再生，且安全性較高，適合開發個性化藥物，所以引起了研究者的關注。研究結果表明，包括DP細胞、不同來源的間充質干細胞、來源于脂肪干細胞和外根鞘細胞等在內的多種細胞通過外泌體的形式調控DP細胞的毛囊誘導能力，促進毛發再生，機制與Wnt等關鍵信號通路活化相關。隨著對外泌體在毛發再生領域的研究，尤其是對DP細胞的增殖和誘導功能作用研究日益深入，發現其有利于延緩和干預DP細胞衰老，維持誘導功能，從而為雄激素性脫發的研究和治療提供新的思路。目前，雖然外泌體在毛發再生方面的研究已取得了一些進展，但如何優化、分離、提純和應用外泌體以及外泌體在毛發再生相關研究的具體分子機制還需進一步研究和探索。