牛跟腱膠原與草魚皮膠原的結構表征及自組裝行為比較

秦子波，余小月，樂薇，榮建華，熊善柏，胡楊，2，3，4＊

（1.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；2.華中農業大學交叉科學研究院，湖北 武漢 430070；3.國家大宗淡水魚加工技術研發分中心（武漢），湖北 武漢 430070；4.華中農業大學深圳營養與健康研究院，湖北 武漢 430070）

引言

動物皮、跟腱等組織中富含I型膠原，是優良膠原的提取原料之一。I型膠原分子是由三條α螺旋鏈相互纏繞形成的右手超螺旋結構，在模擬生理條件下I型膠原分子可以通過分子間的相互作用組裝成具有四分之一錯位排列結構的膠原纖維[1-3]。這種高度有序的膠原纖維組裝體由于具有適宜的理化特性、良好的生物誘導作用和低免疫原性，在皮膚、軟骨、跟腱等組織修復材料領域日益受到重視[4]。據閆鳴艷[3]和Liu等人[5]報道，膠原的分子結構和氨基酸組成以及自組裝條件（如溫度、膠原濃度）會對膠原自組裝行為產生顯著影響。為探究不同來源的膠原在不同條件下自組裝行為的差異，本文將以陸生和水生動物中兩類來源最廣泛的原料（牛源和魚源膠原）為對象，綜合運用圓二色譜（CD）、紫外光譜（UV）、傅里葉變換紅外光譜（FT-IR）、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE）、氨基酸分析和動態流變等手段對牛跟腱膠原和草魚皮膠原的結構特性進行比較，并研究濃度和溫度條件對兩類膠原自組裝行為的影響及組裝動力學差異。本研究試圖從分子結構差異-成纖維動力學-宏觀流變學行為角度，闡明牛跟腱膠原與草魚皮膠原的自組裝行為差異，為牛跟腱膠原和草魚皮膠原分子的組裝行為調控及特性差異研究提供了一定的參考。

1 實驗部分

1.1 主要材料與儀器

豬胃蛋白酶（400 u/mg），購于西格瑪奧德里奇（美國）公司；乙酸、氫氧化鈉、硫酸銨均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。FD-2A型真空冷凍干燥器，北京博醫康實驗儀器有限公司；低溫恒溫槽，北京市聯華工業有限公司；J-1500型圓二色譜儀，日本佳司科公司；Nicolet470傅里葉變換紅外光譜，美國尼高力公司；紫外分光光度計，日本島津公司；L-8900型氨基酸分析儀，日本日立公司；DHR-2型流變儀，美國TA儀器公司；J-26XP型高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司；Bio-Rad電泳儀，美國伯樂公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 膠原提取方法

參考實驗室方法提取牛跟腱膠原和草魚皮膠原[6]。首先，將剪碎的牛跟腱和草魚皮進行脫脂和除雜蛋白處理。隨后，按照1∶50的料液比，將原料加入到含2%的胃蛋白酶（按干質量計）的0.5 mol/L醋酸中，在4℃條件下攪拌浸泡48 h，然后經離心、鹽析、透析和冷凍干燥后得到牛跟腱膠原和草魚皮膠原。

1.2.2 膠原性能表征

1.2.2.1 SDS-PAGE

取凍干后的膠原樣品，用0.5 mol/L醋酸溶解，配制成5 mg/mL膠原溶液。采用12%濃縮膠和5%分離膠，上樣量為15 μL?？捡R斯亮藍R-250染色2 h，然后浸入脫色液中脫色至條帶清析，背景接近無色，最后用凝膠自動成像儀掃描凝膠并保存圖像。

1.2.2.2 UV分析

將膠原溶于0.5 mol/L的醋酸溶液中，配制成0.1 mg/mL膠原溶液，在200～400 nm波長范圍內對膠原進行紫外波長掃描，分辨率為0.2 nm。

1.2.2.3 FT-IR測定

凍干的膠原樣品進行傅立葉變換紅外光譜測試，波數范圍為4000～700 cm-1，掃描次數為64次，分辨率為4 cm-1。

1.2.2.4 CD測定

用0.1 mol/L的醋酸配制成0.5 mg/mL的膠原溶液，在190～240 nm范圍內、室溫條件下進行波長掃描，比色皿光徑為l nm，掃描速度為10 nm/min，間隔1 nm。

1.2.2.5 氨基酸組成分析

取膠原40 mg置于塑料離心管中，加入6 mol/L HCl，在110℃下水解24 h后，過濾,定容至25 mL，取1 mL濾液蒸干，隨后加入1 mL的超純水蒸干，重復進行兩次，再加入1 mL 0.02 mol/L HCl溶解蒸干后的殘留物，上樣前過0.22 μm的水相濾膜。通過氨基酸半自動分析儀測定樣品的氨基酸組分及其含量。

1.2.3 膠原自組裝行為測試

1.2.3.1 膠原濃度對膠原自組裝行為的影響

取不同質量濃度（1、1.2、1.5和2 mg/mL）牛跟腱膠原和草魚皮膠原溶液，在4℃下調節pH至7.0，在37℃下置于313 nm處實時測定膠原的吸光度。

1.2.3.2 溫度對膠原自組裝行為的影響

取2 mg/mL的牛跟腱膠原和草魚皮膠原溶液，在4℃條件下，調節pH至7.0，分別在25、37、42和50℃下，置于313 nm處實時測定膠原的吸光度。

1.2.3.3 自組裝速率的計算

運用式（1）對膠原自組裝生長期進行擬合，該階段的斜率即為自組裝速率。

At為時間t時的吸光度，Ae為自組裝達到平衡時的吸光度，A0為初始吸光度，k是速率常數。

1.2.3.4 流變學性能測定

將自組裝后的膠原凝膠置于平板直徑為40 mm的流變儀中。設置頻率范圍為0.01～10 Hz，應變為2%，溫度為37℃。記錄樣品存儲模量（G'）和損耗模量（G''）。

2 結果分析

2.1 牛跟腱膠原與草魚皮膠原結構特性的比較分析

兩類膠原的SDS-PAGE如圖1a所示，牛跟腱膠原和草魚皮膠原的電泳圖譜相似，均包含α1鏈、α2鏈、β鏈和γ鏈。相對相對分子質量在130 ku附近的α1鏈電泳圖譜強度約為α2鏈的兩倍，與I型膠原的結構一致[7-8]。紫外光譜結果表明，牛跟腱膠原和草魚皮膠原紫外掃描圖譜基本相似，在230 nm處存在較強的吸收峰，這主要是由羰基C=O的n→π*躍遷所致（圖1b）[9]。此外，兩種膠原在280 nm處無明顯的吸收峰，說明提取得到膠原中芳香族氨基酸含量較低，這與后續的氨基酸分析結果相一致。從圖1c可以看出兩類膠原的傅里葉變換紅外圖譜均存在I型膠原典型的5個特征酰胺帶，牛跟腱膠原和草魚皮膠原的酰胺A帶分別出現在3434 cm-1、3436 cm-1處，與草魚皮膠原相比，牛跟腱膠原的酰胺A帶發生了部分紅移，這表明牛跟腱膠原分子中的部分基團參與形成了更多的分子間或分子內氫鍵[10]。此外，牛跟腱膠原和草魚皮膠原的酰胺B帶分別出現在2931 cm-1和2934 cm-1處，這歸因于CH2基團的不對稱伸縮振動；酰胺I帶分別出現在1650 cm-1和1654 cm-1處，主要與多肽鏈上C=O的伸縮振動有關[11]；酰胺II帶出現在1552 cm-1處，由N-H彎曲振動和C-N拉伸振動產生[12]；酰胺III帶出現在1241 cm-1附近，由C-N拉伸振動和N-H彎曲振動產生[13]。同時，兩種膠原酰胺III帶的峰值與1454 cm-1的峰值比近似為1.0，這表明兩種膠原的三股螺旋結構保持完整[14-15]。圓二色譜結果表明，牛跟腱膠原和草魚皮膠原的負吸收峰均出現在199 nm處，正吸收峰分別出現在222 nm和221 nm處，且兩者的RPN值（正負吸收峰比值的絕對值）分別為0.197和0.179，表明兩類膠原均具有較為完整的三股螺旋結構，這與文獻報道的結果相似（圖1d）[16-17]。氨基酸結果表明（表1），兩種膠原具有相似的氨基酸組成，甘氨酸（Gly）含量最高，占氨基酸總量的30%以上，其次為脯氨酸（Pro）與羥脯氨酸（Hyp），但同時發現，牛跟腱膠原的亞氨基酸（Pro+Hyp）的含量為25.4%，明顯高于草魚皮膠原的亞氨基酸含量（19.42%），而亞氨基酸分子中的吡咯環有利于穩定膠原的三螺旋結構，亞氨基酸含量越高，膠原穩定性越好[10，18]。

圖1 牛跟腱膠原和草魚皮膠原的SDS-PAGE圖（a）、UV圖譜（b）、FT-IR圖譜（c）和CD圖（d）Fig.1 SDS-PAGE patterns(a),UV spectra(b),FT-IR spectra(c)and CD curves(d)of bovine achilles tendon collagen and grass carp skin collagen

表1 牛跟腱膠原和草魚皮膠原氨基酸組成（%）Tab.1 Amino acid compositions of bovine achilles tendon collagen and grass carp skin collagen(%)

2.2 膠原濃度對膠原自組裝性能的影響

膠原濃度對自組裝行為的影響如圖2（a、b）所示?？梢钥闯?，自組裝過程分為三個階段，分別為成核期、生長期和平衡期[19]。隨著膠原濃度的增加，膠原的自組裝進程加快，這表明提高膠原濃度能夠加快膠原自組裝進程[20]。當膠原質量濃度較低時（＜1 mg/mL），單位體積溶液中膠原分子數量較少且大多以游離形式存在，成核中心分子間的相互作用力較弱，導致組裝過程中形成的膠原纖維數量較少；而當濃度增大時，體系中膠原的分子數量增多，從而有利于自組裝的進行，尤其是當牛跟腱膠原質量濃度為2 mg/mL時，在120 s內膠原溶液的濁度值迅速上升至1.401，這與陳元昊[21]和閆鳴艷[22]等人的研究結果相似。圖2（c、d）中t1/2是指自組裝的半周期，半周期越短則膠原溶液自組裝速率越大；△h是初始吸光值與平衡期吸光值之差。從圖中可以看出，隨著膠原濃度的增加，膠原自組裝半周期（t1/2）縮短且△h變大，當膠原質量濃度由1 mg/mL升至2 mg/mL時，草魚皮膠原的t1/2從230 s縮短至140 s，△h則從0.467升至0.992；而牛跟腱膠原的t1/2從210 s縮短至60 s；△h則從的0.521升至1.144。這說明增加膠原濃度能夠加快膠原的自組裝進程。

圖2 (a)和(b)為不同濃度膠原的自組裝濁度曲線（a為牛跟腱膠原、b為草魚皮膠原），（c）和(d)為膠原自組裝半周期（t1/2）及吸光度增加值（Δh)）（c為牛跟腱膠原、d為草魚皮膠原）Fig.2 (a)and(b)represent the turbidity curves of collagen self-assembly at different concentrations(a:bovine achilles tendon collagen,b:grass carp skin collagen).(c)and(d)represent the half cycle of collagen self-assembly(t1/2)and the increase in absorbance(Δh)(c:bovine achilles tendon collagen,d:grass carp skin collagen)

2.3 膠原濃度對膠原自組裝動力學的影響

為了探究不同膠原濃度對膠原自組裝動力學的影響，運用式1對圖2（a、b）濁度測定數據進行曲線擬合，得到相應的膠原自組裝動力學擬合曲線（圖3、圖4）和膠原在生長期的自組裝動力學參數（表2），其中k表示生長期的組裝速率。

表2 不同質量濃度下牛跟腱膠原和草魚皮膠原的自組裝參數Tab.2 Self-assembly parameters of bovine achilles tendon collagen and grass carp skin collagen at different mass concentrations

圖3 不同質量濃度下牛跟腱膠原自組裝動力學擬合曲線Fig. 3 Fitting curves of self-assembly kinetics of bovine achilles tendon collagen at different mass concentrations

圖4 不同質量濃度下草魚皮膠原自組裝動力學擬合曲線Fig.4 Fitting curves of self-assembly kinetics of grass carp skin collagen at different mass concentrations

隨著膠原濃度的增加，兩種膠原的自組裝速率呈現不斷上升的趨勢，當膠原質量濃度從1 mg/mL升至2 mg/mL時，草魚皮膠原的自組裝速率由0.15×10-4升至2.50×10-4，而牛跟腱膠原的自組裝速率則從0.32×10-4升至3.01×10-4。此外，在膠原濃度相同的情況下，牛跟腱膠原的自組裝速率要高于草魚皮膠原，這表明了兩種膠原在分子結構上的差異導致膠原自組裝存在一定差異[23]。

2.4 溫度對膠原自組裝性能的影響

兩種膠原在不同溫度條件下的自組裝行為變化情況，如圖 5 所示。由圖 5（a、b）可知，當溫度為25 ℃時，草魚皮膠原發生自組裝，而牛跟腱膠原的自組裝行為較差，吸光度變化較小。當溫度升至37 ℃，兩種膠原展現出高效的自組裝行為，且平衡期的濁度顯著升高，尤以牛跟腱膠原變化最為明顯，其濁度值由25 ℃時的0.270 升至1.407，而草魚皮膠原的濁度值由 25 ℃時的 1.175 升至1.337。當溫度為42 ℃時，草魚皮膠原開始變性，不具備自組裝能力，而牛跟腱膠原雖具備自組裝能力，但與37 ℃時相比其自組裝性能開始下降，且平衡期的濁度值降至1.180。當溫度達到50 ℃時，高溫引起牛跟腱膠原變性，三螺旋結構解旋生成明膠，不具備自組裝能力，其成核期吸光度的上升是由于傳熱不均導致的[24]。由于陸生和水生生物的最適生長環境以及亞氨基酸含量的不同，導致兩種膠原在不同溫度下的自組裝性能出現差異。從圖 5（c、d）中可以看出，在一定范圍內隨著溫度的升高，膠原自組裝半周期（t1/2）縮短且△h變大。當溫度從25 ℃升至37 ℃時，草魚皮膠原的t1/2從 360 s 縮短至140 s，△h則從 0.860 升至 0.992；而牛跟腱膠原的△h則從的0.137 升至1.144。這進一步說明了升高溫度能夠加快膠原的自組裝進程[25]。

2.5 溫度對膠原自組裝動力學的影響

為了探究不同溫度對膠原自組裝動力學的影響，運用式（1）對圖 5（a、b）濁度測定數據進行分析，得到自組裝動力學擬合曲線（圖6、圖7）和膠原在生長期的自組裝動力學參數（表 3），其中 k 表示生長期的組裝速率。由表3 可知，當溫度為37 ℃，牛跟腱膠原和草魚皮膠原的組裝速率分別達 到 最 大 值 3.01 ×10-4和2.50×10-4，而當溫度繼續升高時，牛跟腱膠原的組裝速率開始下降，草魚皮膠原發生變性，不具備自組裝能力，未獲得自組裝速率常數。當溫度達到50 ℃時，未得到牛跟腱膠原的速率常數，說明牛跟腱膠原發生變性，也不再具有自組裝的能力。因此，適度提高溫度有助于膠原的自組裝，但溫度過高時會導致膠原變性，使膠原無法進行自組裝。金達麗的研究也表明在一定范圍內提高溫度對膠原自組裝有促進作用[26]。

圖5 (a)和(b)為不同溫度膠原的自組裝濁度曲線（a 為牛跟腱膠原、b 為草魚皮膠原），(c)和(d)為膠原自組裝半周期(t1/2)及吸光度增加值(Δh)(c 為牛跟腱膠原、d 為草魚皮膠原)Fig. 5 (a)and(b)represent the turbidity curves of collagen self-assembly at different temperatures(a:bovine achilles tendon collagen,b:grass carp skin collagen).(c)and(d)represent the half cycle of collagen selfassembly(t1/2)and the increase in absorbance(Δh)(c:bovine achilles tendon collagen,d:grass carp skin collagen)

圖6 不同溫度下牛跟腱膠原自組裝動力學擬合曲線Fig. 6 Fitting curves of self-assembly kinetics of bovine achilles tendon collagen at different temperatures

圖7 不同溫度下草魚皮膠原自組裝動力學擬合曲線Fig. 7 Fitting curves of self-assembly kinetics of grass carp skin collagen at different temperatures

表3 不同溫度下牛跟腱膠原和草魚皮膠原的自組裝參數Tab. 3 Self-assembly parameters of bovine achilles tendon collagen and grass carp skin collagen at different temperatures

2.6 動態頻率掃描

圖8 為不同質量濃度（1.5 mg/mL 和 2 mg/mL）下牛跟腱膠原和草魚皮膠原在37 ℃下組裝成凝膠后的動態掃描曲線圖。在相同的濃度條件下，兩類膠原的存儲模量均高于其損耗模量，表明膠原分子組裝形成的凝膠具有明顯的彈性特征。在質量濃度為1.5 mg/mL 時，牛跟腱膠原的彈性模量從0.98 Pa 快速上升至4.76 Pa，草魚皮膠原則從1 Pa 上升至4.1 Pa，牛跟腱膠原在同樣的頻率下其彈性模量大部分高于魚膠原，在質量濃度為2 mg/mL時也發現了類似的現象，這可能是因為牛膠原中的亞氨基酸含量（Pro+Hyp）要高于草魚皮膠原，導致膠原組裝成凝膠的過程中其剛性較強[27]，該結果也與前文中氨基酸組成的差異相一致。

圖8 不同質量濃度下（1.5 mg/mL 和2 mg/mL）牛跟腱膠原和草魚皮膠原在37 ℃下組裝成凝膠后的動態掃描曲線圖（G'為存儲模量，G''為損耗模量）Fig. 8 The dynamic scan profiles of bovine achilles tendon collagen hydrogel and grass carp skin collagen hydrogel assembled at 37 ℃at different mass concentrations(1.5 mg/mL and 2 mg/mL) (G' is the storage modulus and G'' is the loss modulus)

3 結論

采用“酸-酶”結合法制備了具有良好三股螺旋結構的牛跟腱膠原和草魚皮膠原，兩類膠原具有類似的光譜學特征和二級結構，但其氨基酸組成存在一定差異，牛跟腱膠原的亞氨基酸（Pro+Hyp）含量比草魚皮膠原高約6%。膠原濃度和環境溫度對其自組裝行為有較大影響，隨著濃度增加，膠原自組裝進程加快，自組裝后凝膠的動態粘彈性升高。此外，在相同濃度下牛跟腱膠原的自組裝速率高于草魚皮膠原，且自組裝后膠原凝膠的動態粘彈性較高。同時，在一定溫度范圍內，升高溫度對膠原自組裝有促進作用，而過高或過低的溫度都會對膠原自組裝產生不良影響。當溫度為25 ℃時，牛跟腱膠原未進行自組裝，而草魚皮膠原可以進行自組裝，當溫度升至37 ℃時，兩種膠原都展現出高效的自組裝行為。而當溫度繼續升高時，膠原會發生變性，牛跟腱膠原的熱穩定性更高，這與其亞氨基酸組成密切相關，整體而言，牛跟腱膠原的自組裝效果優于草魚皮膠原。