卡拉膠/α-淀粉酶復合凍融穩定性對饅頭的影響

黎鈞鑄，黃文晶，沈汪洋，王 展，黃慶榮，金偉平

（武漢輕工大學食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023）

冷凍面團技術是把面團低溫冷凍處理為半成品或成品，方便烘焙類食品加工的商業化生產的一種工藝[1]。冷凍面團加工有效解決了食品淀粉老化、口感變劣、貨架期短等問題，同時降低了面制品的生產成本，提高面團質量控制能力以及產品的新鮮度和穩定性[2]。但也出現一些問題，例如冷凍過程會使面筋結構損壞、酵母活性減弱、后期醒發時間延長、酸味明顯、膨脹力變差、影響外觀等[3]。

α-淀粉酶是一種常用于面制品加工的酶制劑。一方面，它能促使淀粉分解產生更多的糖來補償面團加工過程中糖的損失，為發酵提供能量[4]；另一方面，α-淀粉酶分解淀粉部分產物為麥芽糖、糊精等，抑制淀粉重結晶，從而延緩面制品老化、增加產品比容。陳書明等通過測試不同濃度α-淀粉酶、木聚糖酶對冷凍酵母的影響，發現冷凍1 d 時，添加0.4 g/kg α-淀粉酶的面團中酵母存活率達到98%以上，抗凍性明顯提高[5]。

食品是一種多組分共存的復雜體系，共存物對α-淀粉酶的結構變化及其加工敏感性均有一定的影響。Giannone 等人將脂肪酶制劑與4 種不同商品淀粉酶進行復配使用，結果顯示α-淀粉酶和脂肪酶在防止老化方面呈現顯著協同作用，有效改善樣品的柔軟性和耐咀嚼度[6]。林娟娟等人發現在面團中添加α-淀粉酶、脂肪酶和半纖維素酶，使面包組織結構更加細膩，口感較柔軟[7]。王建芳等人將淀粉酶和谷氨酰胺轉氨酶混合加入燕麥和小麥混合粉面團中，使面團的色澤以及流變特性更接近小麥面團，但當體系存在黃原膠時，這兩種酶的改善效果未得到提升[8]。

卡拉膠作為一種天然親水膠體可顯著改善冷凍食品的外觀，降低冰晶的形成速度，改善面筋蛋白流變學特性[9]，從而提高冷凍食品體系的穩定性。親水膠體的添加可減少自由水，增加結合水，通過組分間相互作用形成新結構，從而提升產品體系在低溫環境下的穩定性。在食品加工過程中，多糖膠體的存在及分子結構對蛋白質/酶結構的影響和相互作用是一個亟待研究的問題。單一α-淀粉酶對面團的作用效果已有很多研究，而λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物在冷凍面團及其面制品中的研究相對較少。作者首先研究了λ-卡拉膠對凍融過程中α-淀粉酶性質的影響，進而探究了復合物對冷凍面團發酵性能及饅頭的比容、質構、孔隙分布等參數的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-淀粉酶（EC 3.2.1.1，來源于地衣芽孢桿菌）、λ-卡拉膠：均購自阿拉?。ㄖ袊虾＃?；其他化學品包括碘、碘化鉀、氯化鈉、可溶性淀粉、考馬斯亮藍：均購自國藥化學試劑有限公司（中國上海）；多用途麥芯小麥粉：購自益海嘉里糧油有限公司（中國上海）；高活性干酵母：購自安琪酵母有限公司（中國宜昌）。研究中使用的化學品均為試劑級，在使用前沒有經過任何純化。

1.2 儀器與設備

UV-5500PC 型紫外可見光分光光度計：上海元析儀器有限公司產品；F-4600 型熒光分光光度計：日本日立公司產品；ME104E 型電子分析天平：瑞士梅特勒-托利多公司產品；NG 吹泡稠度儀：法國肖邦技術公司產品；發酵流變儀：法國肖邦技術公司產品；食品體積測定儀：瑞典波通儀器公司產品；食品圖像分析儀：瑞典波通儀器公司產品；TA 物性測試儀：英國Stable Micro System 公司產品；FiveEasy Plus 型pH 測定儀：瑞士梅特勒-托利多公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物的制備取一定量α-淀粉酶和λ-卡拉膠樣品分別配制質量濃度為0.2 mg/mL 的母液，α-淀粉酶室溫攪拌30 min 至完全溶解，λ-卡拉膠85 ℃攪拌2 h 完全溶解。將配制好的α-淀粉酶和λ-卡拉膠母液以體積比10∶1 的比例混合，α-淀粉酶終質量濃度為0.1 mg/mL，調節溶液pH 為5.0，置于4 ℃冰箱充分溶解，過夜后使用。

1.3.2 凍融循環處理將配置好的α-淀粉酶以及λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物置于-20 ℃冰箱冷凍，12 h 后取出置于室溫解凍2 h，記作第1 次凍融（F1），再將解凍好的樣品放入-20 ℃的冰箱中冷凍12 h，取出后在室溫中解凍2 h，記為第2 次凍融（F2），同樣的方法進行第3 次凍融（F3）。

1.3.3 α-淀粉酶的酶活測定依據GB1886.174-2016 酶制劑活性測定法，測定α-淀粉酶的酶活，并略做修改。吸取1 mL 可溶性淀粉溶液于離心管中，加入0.25 mL 的0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH 6.0），搖勻后，置于60 ℃恒溫水浴中預熱8 min 以上。加入0.05 mL 稀釋好的待測酶液，搖勻反應5 min，吸取0.05 mL 反應液，加到預先盛有0.025 mL 鹽酸溶液和0.25 mL 稀碘液的離心管中，搖勻，并以0.025 mL 鹽酸溶液和0.25 mL 稀碘液為空白，于660 nm波長下用酶標儀測定其吸光度，計算酶液的酶活性。用Bradford 法在595 nm 處測定其吸光度，計算蛋白質比例，得到酶活（U/mg）。

1.3.4 內源熒光分析將經凍融處理后的α-淀粉酶以及λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物稀釋50 倍，使用日立F-4600 熒光分光光度計測內源熒光，儀器設置參數如下：激發波長280 nm，掃描波長范圍300～500 nm，掃描速度240 nm/min，狹縫寬度5 nm，激發電壓700 V。

1.3.5 粒徑與電位分析使用馬爾文動態光散射儀對經凍融處理后的α-淀粉酶以及λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物進行粒徑分布以及電位的測量。粒徑稀釋100 倍，避免多重光散射。

1.3.6 面粉水分質量分數的測定參考國家標準食品中水分的測定（GB 5009.3—2016）中的直接干燥法，計算出面粉水分質量分數。

1.3.7 發酵加水量的測定根據國家標準小麥粉面團流變特性測定（GB/T 14612.4—2005）中的表格查出被測面粉水分質量分數應加入的氯化鈉溶液毫升數。

1.3.8 發酵性能的測定取250 g 面粉，3 g 干酵母，5 g 鹽和150 mL 未凍融處理的樣品溶液（0.1 mg/mL α-淀粉酶溶液；0.1 mg/mL λ-卡拉膠溶液；λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物（酶質量濃度0.1 mg/mL）；空白溶液），采用肖邦吹泡儀和面，和面結束后用保鮮膜包好面團，立即放入冰箱冷凍。12 h 后拿出解凍，取315 g 面團置于發酵流變儀中，測試參數為：28.5 ℃，4 h。

1.3.9 冷凍面團的制備500 g 面粉，6 g 干酵母，120 mL 水（發酵實驗加水量的80%）。在和面機中依次均勻倒入面粉、酵母和樣品溶液，常溫下和面6 min 后取出，迅速切割并揉捏成80 g/個的面團，用保鮮膜包好并做好標記，放入冰箱貯存12 h，即得到冷凍面團。

1.3.10 饅頭的制備 參照GB/T 35991—2018 方法并略有改進[10]。將冷凍面團在常溫下解凍，設定恒溫發酵箱的溫度為35 ℃，相對濕度為83%，放入面團發酵30 min，再放入電蒸鍋的上層蒸15 min 左右，?；鸷笪鸫蜷_鍋蓋，繼續燜3 min 后取出冷卻待用。

1.3.11 饅頭孔隙分布的測定將饅頭切成厚片狀，校準儀器后，取中間一塊切片放在C-Cell 圖像分析儀的樣品盒中，分析得到饅頭切片的6 張圖像和氣孔的各項數據[11]。

1.3.12 饅頭質構的測定取饅頭樣品，在饅頭中心處切出邊長為2 cm 的正方體，用TA 物性測試儀的TPA 模式進行測定。參數設置：探頭型號為P/45R；測前速度、測中速度、測后速度均為3 mm/s；下壓程度50%；觸發力5.0 g，得到饅頭的硬度、彈性等數據[12]。

1.3.13 饅頭比容的計算參照GB/T 35991—2018，取饅頭樣品稱其質量，用食品體積測定儀測定饅頭的體積和高度，并計算出饅頭的比容[10]，公式如下：

式中：v為比容，mL/g；V為體積，mL；m為質量，g。

1.4 數據統計分析

每個實驗設置3 組平行實驗，最終數據以3 次平行實驗的平均值和標準偏差來表示，結果通過SPSS18 軟件做單因素方差分析，顯著性水平P＜0.05，圖表采用Origin 2019 繪制。

2 結果與分析

2.1 凍融次數對α-淀粉酶及λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物結構的影響

不同凍融處理后的α-淀粉酶和λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物的剩余酶活見圖1。隨著凍融次數增加，α-淀粉酶剩余酶活呈下降趨勢。凍融1 次，α-淀粉酶酶活下降到88%，此時α-淀粉酶發生冷凍變性[13]。胡海玥等人發現經冷凍處理后的大豆分離蛋白穩定性以及乳化性質都有所下降[14]。增加凍融次數，α-淀粉酶酶活性的下降趨勢趨于平緩并最終穩定在79%。然而λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物剩余酶活在凍融一開始就大幅下降。在相同的凍融次數下，復合物的酶活也顯著低于原酶，推測λ-卡拉膠與α-淀粉酶的相互作用在凍融過程中促進了α-淀粉酶結構的展開。

圖1 α-淀粉酶和λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物經不同次數凍融處理后的剩余酶活Fig.1 Enzyme activity retention of α-amylase and λcarrageenan/α -amylase complex after different freeze-thaw cycles

內源熒光強度常用來表明蛋白質在三級結構水平上的構象變化[15]，圖2顯示了α-淀粉酶及λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物經不同次數凍融后內源熒光的變化。蛋白質的內源熒光來自色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，其熒光光譜對環境極為敏感，其中色氨酸的熒光強度最大，當最大吸收波長大于330 nm時，證明此時色氨酸殘基暴露于外部的極性環境中[16]。在凍融1～2 次后，α-淀粉酶內源熒光強度增大，表明色氨酸殘基微環境極性增加，更多發光基團暴露于溶液中。凍融到第3 次時，熒光強度顯著降低，α-淀粉酶三級結構發生變化，色氨酸的微環境從疏水內核轉移到蛋白質表面，極性增大，從而導致熒光強度快速下降，同時位于疏水區域的活性位點也發生改變，酶活性降低。λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物內源熒光強度隨著凍融次數的增加而降低，復合物熒光強度的降低是因為λ-卡拉膠與α-淀粉酶通過靜電相互作用形成復合物，蛋白質分子上的色氨酸殘基在結合中被掩蓋[17-18]。在相同凍融次數下，復合物的熒光猝滅程度要顯著大于α-淀粉酶的猝滅程度，三級結構變化更為劇烈，這與酶活的變化趨勢相同。

圖2 α-淀粉酶和λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物經不同次數凍融處理后的內源熒光強度Fig.2 Intrinsic fluorescence of α -amylase and λ -carrageenan/α-amylase complex after different freeze-thaw cycles

如圖3所示，粒徑表明凍融前后α-淀粉酶以及λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物的聚集情況。單獨的α-淀粉酶水合粒徑約為5 nm，當α-淀粉酶與λ-卡拉膠形成靜電復合物之后粒徑增大到24 nm。經多次凍融后，α-淀粉酶粒徑隨著凍融循環次數的增加依次增大，在凍融3 次后粒徑增大到190 nm，此時α-淀粉酶三級結構展開，在疏水相互作用的驅動下發生聚集。α-淀粉酶與λ-卡拉膠通過靜電相互作用形成的復合物在凍融多次后粒徑無明顯增大，推測此時多糖的存在抑制了α-淀粉酶的聚集。

圖3 α-淀粉酶和λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物經不同次數凍融處理后的粒徑分布Fig.3 Particle size distribution of α-amylase and λcarrageenan/α -amylase complex after freeze -thaw cycles

2.2 α-淀粉酶及復合物對面團發酵性能的影響

F4 面團流變發酵儀通過記錄面團發酵期間面團發酵的高度、二氧化碳氣體的產生量來測量面團面筋網絡的持氣能力和酵母的發酵能力，見表1?？梢钥闯?，添加α-淀粉酶、λ-卡拉膠和復合物后的面團發酵膨脹高度均高于空白組，即α-淀粉酶、λ-卡拉膠和λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物均能促進面團發酵。α-淀粉酶可將淀粉分解為糊精、麥芽糖或葡萄糖等簡單化合物，為酵母提供充足的碳源，促進酵母的生長和繁殖，極大提高酵母發酵產氣，增大面制品體積[19]。λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物的膨脹高度要小于α-淀粉酶，酶在促進發酵上的作用顯著大于卡拉膠，說明酶的活性起決定性作用[20]。由于λ-卡拉膠與α-淀粉酶形成靜電復合物后酶活顯著下降，因此在凍融過程中α-淀粉酶分解淀粉的能力降低，促進酵母增殖效果有限，導致了面團膨脹小。

從總產氣體積的數據可知，含有α-淀粉酶和λ-卡拉膠的組別總產氣量均高于空白組。一方面λ-卡拉膠中大量的羥基使它與面團中的水分子以氫鍵形式結合，減少水分的散失，利于酵母繁殖并提高酵母細胞的活性[21]。另一方面，λ-卡拉膠可提升水相黏度，增加產氣氣體包裹液膜的延展性和強度，優化面筋網絡結構，提升面團持氣能力[22]。復合物組與α-淀粉酶組則無顯著性差異，這是因為λ-卡拉膠不參與面團氣體的產生，α-淀粉酶在其中發揮主要作用，因此總產氣體積無顯著變化。

2.3 α-淀粉酶及復合物對饅頭比容的影響

饅頭比容受酵母的產氣能力與面筋網絡結構的持氣能力兩個因素影響，圖4為不同添加組分對饅頭比容的影響。含有α-淀粉酶、λ-卡拉膠和復合物的饅頭比容均比空白對照組大（2.51 mL/g），其中添加α-淀粉酶的比容最大，達到2.73 mL/g。在凍融過程中大約有20%的酵母細胞死亡，α-淀粉酶水解淀粉產生小分子糖可供能酵母菌，增加產氣量。另一方面，冷凍過程形成的冰晶會破壞面筋蛋白網絡結構，制約饅頭體積增大。少量的α-淀粉酶可部分破壞淀粉顆粒，使淀粉與面筋蛋白之間的結合更充分，增加面筋強度，提升持氣能力，增大饅頭比容，使外觀更蓬松更美觀。類似的現象在添加木聚糖酶的全麥粉面包中也有發現，木聚糖酶水解阿拉伯木聚糖，導致面包比容增大[22]。另外，λ-卡拉膠作為一種陰離子多糖，能通過氫鍵吸附大量自由水，提高面筋蛋白持水性。添加了復合物的饅頭比容要低于添加α-淀粉酶組，但顯著高于λ-卡拉膠組和空白組，說明復合物能有效保護面團網絡結構的完整性，保持面團持氣性。但由于α-淀粉酶和λ-卡拉膠形成復合物后，λ-卡拉膠抑制了α-淀粉酶的活性，同時部分λ-卡拉膠參與靜電復合，結合水能力降低，削弱酶對饅頭品質的影響。

圖4 不同添加組分對饅頭比容的影響Fig.4 Effects of different additives on the specific volume of steamed bread

2.4 α-淀粉酶及復合物對饅頭質構的影響

饅頭的質構特性是與感官性質聯系較為緊密的指標，其中，彈性與饅頭品質呈正相關，彈性數值大，品質好；而硬度與饅頭和面包品質呈負相關[23]。面團質構的變化主要有3 大影響因素：一是面團在冷凍過程中，由于冰晶的作用使水分重新分布，引發面筋蛋白分子解聚，形成的面筋黏彈網絡結構遭到破壞[24]；二是冷凍導致面筋蛋白低溫變性，使其隱藏在其內部的部分疏水基團暴露，面筋蛋白持水性減弱[25]；三是損傷淀粉的含量增加，淀粉吸水率增強，使水分從面筋基質中流出，面團發黏且不易成型，彈性和可伸展性下降[26]。

圖5為不同添加組分對饅頭硬度和彈性的影響。與空白組相比，添加α-淀粉酶、λ-卡拉膠和λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物均不同程度降低了饅頭的硬度，增加彈性。λ-卡拉膠對饅頭硬度有顯著影響，但對彈性影響不大，推測原因為λ-卡拉膠的硫酸根陰離子基團能與面筋精氨酸中帶正電荷的基團通過靜電相互作用形成復合物，改變面筋蛋白疏水性，從而提高面團持水能力[27]。α-淀粉酶可以顯著降低饅頭的彈性，提升饅頭的柔軟度，對比復合物組發現，饅頭的硬度降低，彈性增加不明顯，推測α-淀粉酶和λ-卡拉膠之間發生了相互作用，λ-卡拉膠類似于α-淀粉酶抑制劑。結果表明，酶制劑和親水膠體都能改良饅頭的品質，但在實際生產中應該結合其對面團、饅頭性質的影響來調整添加水平，而復合物對饅頭質構特性的影響要弱于酶制劑，強于親水膠體。

2.5 α-淀粉酶及復合物對饅頭孔隙分布的影響

C-Cell 圖像分析儀可得到饅頭內部紋理氣孔參數和切片圖像。饅頭內部組織結構的細膩程度直接影響消費者的體驗感。有研究表明，氣孔數量和孔洞數量與比容的相關系數高達90%。通常品質好的饅頭具有氣孔數量多、孔洞數量少、氣孔直徑小、孔壁薄、比容大等基本特征。如表2所示，3 組不同添加物饅頭的氣孔數量顯著多于空白組，但孔洞數量和孔壁厚度均小于空白組，說明α-淀粉酶和λ-卡拉膠能使饅頭的內部結構更細膩、更穩定。其中添加λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物組分的氣孔數量和氣孔面積略低于單獨添加酶的組分，氣孔直徑則接近于單獨添加多糖的實驗組?？傊?，λ-卡拉膠的添加弱化了α-淀粉酶的作用效果，該結果與饅頭的比容和質構等測試結果一致。

表2 添加不同組分對饅頭孔隙分布的影響Table 2 Effects of different additives on the pore distribution of steamed bread

情況較典型的實驗組的C-Cell 切片見圖6。綠色部分為饅頭的大孔洞，深藍色部分為正常的氣孔部分，而較淺的藍色部分表示氣孔分布不均勻。

圖6 不同添加組分對饅頭孔隙組織的影響Fig.6 Effects of different additives on the pore structure of steamed bread

可以看到空白組含有綠色的大孔洞，λ-卡拉膠組有少許淺綠色的小孔洞，而添加α-淀粉酶和λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物的饅頭幾乎不存在孔洞且氣孔分布較均勻。推測原因為復合物中過量的卡拉膠增加了面筋蛋白的持水能力，同時復合物的存在增強了面筋網絡的穩定性，進一步說明了α-淀粉酶與λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物均能使饅頭內部結構更加緊密細膩。

3 結 語

作者系統研究了α-淀粉酶、λ-卡拉膠和λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物對冷凍面團及其饅頭制品性能的影響。結果表明，在凍融過程中α-淀粉酶結構受到較大影響，酶活顯著降低，且λ-卡拉膠在凍融過程中通過相互作用顯著鈍化α-淀粉酶酶活。面團性能測試表明，α-淀粉酶能提升面團的發酵能力，基本消除冷凍對酵母活性和面團結構帶來的負面影響，而λ-卡拉膠對面團發酵性能的促進作用有限。λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物對面團的作用劣于α-淀粉酶，推測原因為在凍融循環過程中多糖與酶結合，屏蔽了酶部分作用位點，從而抑制了其活性，但同時λ-卡拉膠也能增加面筋蛋白的持水性，穩定面筋網絡。添加一定量的α-淀粉酶、λ-卡拉膠和λ-卡拉膠/α-淀粉酶復合物均能降低饅頭的硬度，增加彈性，使饅頭氣孔分布均勻且減少孔洞。