急性胰腺炎患者血清微小RNA-340-3p、CXC趨化因子配體-13和CXC趨化因子配體-16的表達意義

劉 偉，支 媛，高 璐，滕 萱，陸 雙

(錦州醫科大學附屬第一醫院產科，遼寧 錦州 121000)

急性胰腺炎的發病率及病死率逐年升高，輕型急性胰腺炎預后較好，而重型急性胰腺炎病情重，病變常進展迅速，可合并多器官功能障礙、膿毒癥等危及生命的并發癥[1-2]。早期診斷及干預是防止急性胰腺炎病情加重的關鍵。近年學者關注到血清中的相關因子與病變的形成和進展相關。CXC趨化因子配體13(CXCL-13)、CXC趨化因子配體16(CXCL-16)屬于趨化因子家族，由次級淋巴器官中的濾泡樹突細胞和組織細胞產生，能與表達在B淋巴細胞、T淋巴細胞及濾泡樹突細胞表面的CXCR-5相結合，引起B淋巴細胞及T淋巴細胞在炎性區域聚集，促進淋巴濾泡的形成[3]。近年學者研究發現兩者在炎性疾病的形成中具有一定作用[4-5]。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是學者在研究中發現的能調控炎性疾病形成的因子，主要是對下游靶基因進行調控發揮生物學作用[6]。微小RNA-340-3p(miR-340-3p)是一種與炎性反應和腫瘤增殖相關的多功能miRNA，其下游因子較多，也是其功能復雜的重要因素[7]。在生物信息預測時本課題組發現miR-340-3p均與CXCL-13、CXCL-16有可結合的位點。本研究檢測急性胰腺炎患者血清中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16的表達特征，分析其相關性及在病變進展中的價值，以期為臨床工作提供幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2021年8月至2022年6月于我院明確診斷為急性胰腺炎69例作為觀察對象。病例納入均符合《中國急性胰腺炎診治指南(2019)》中的標準，即符合下述3項中2項：①符合急性胰腺炎腹痛特征；②血清淀粉酶和(或)脂肪酶濃度上調至3倍及以上；③腹部影像學表現支持?；颊呔鶠槭状伟l病，24 h內入院就診。排除標準：慢性胰腺炎、自身免疫性疾病史、惡性腫瘤史、合并嚴重的高血壓及肝腎功能不全者。本研究經倫理委員會批準，家屬均簽署知情同意書。依據2012年亞特蘭大的標準進行分級。輕癥：無壞死及器官功能障礙；中重癥：一過性器官功能障礙，或伴有局部或全身并發癥；重型：持續性(>48 h)器官功能障礙伴感染性胰腺壞死。

1.2 檢測方法 患者確診后抽取3 ml空腹靜脈血后，離心(3000 r/min)20 min后，將血清分離，并置于-80 ℃冰箱中凍存。樣本集中檢測，由同一檢驗師操作，并均于1個月內完成。

1.2.1 qRT-PCR檢測miR-340-3p ：應用實時熒光定量PCR法(qRT-PCR法)檢測miR-340-3p的表達。TriZol提取總RNA(TriZol購于美國invitrogen)。應用逆轉錄合成cDNA，引物由上海通生工公司合成，miR-340-3p上游：5’-ACTGCTGCTGTGTGGTGAC-GTACG-3’，下游：5’-GCACGTGCGCACGTCGTGTTATT-3’。以U6作為內參，引物上游：5’-GGCA-GAAACGTGGAACCG-3’下游：5’-TTGGAACAGT-GGGCAAATTC-3’。擴增程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s；延伸。以2-ΔΔCt法表示結果。

1.2.2 CXCL-13和CXCL-16的檢測：應用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)檢測血清中CXCL-13和CXCL-16的表達。CXCL-13(ab269370)和CXCL-16(ab197744)均購自英國Abcam公司。取出凍存血清，自然融化后，輕輕振蕩混勻，加入100 μl標準品、樣品和對照品，貼上封板膜，37 ℃孵育90 min后進行洗滌，加入100 μl工作液，孵育60 min，洗滌后加入100 μl ABC工作液，37 ℃孵育30 min，PBS洗滌5次，加90 μl TMN顯色劑，37 ℃孵育2 min后，每孔加入準備好的TMN stop solution，顏色立刻變為黃色，應用酶標儀式檢測(450/546 nm雙波長)，測定各孔OD值。以標準品濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，制作標準曲線，計算其余各孔樣本濃度。

2 結 果

2.1 兩組一般資料比較 收集病例中男35例，女34例，有吸煙史者為19例，無吸煙史者為50例；年齡30～75歲，平均(50.53±5.37)歲，體重指數(BMI)范圍17.1～32.2 kg/m2，平均(23.61±2.56)kg/m2。對照組中男33例，女36例，有吸煙史者為15例，無吸煙史者為54例；年齡27～60歲，平均(47.09±5.35)歲，BMI范圍18～29 kg/m2，平均(22.21±1.52) kg/m2。兩組在常規資料比較中差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16表達比較 兩組miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16的表達差別有統計學意義(P<0.05)，即觀察組中miR-340-3p的表達下調，CXCL-13和CXCL-16的表達升高。見表2。

表2 兩組中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16表達比較

2.3 觀察組不同臨床特征中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16表達的差異 miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16在觀察組不同病變分級的表達中差異有統計學意義(P<0.05)，miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16在不同性別、年齡、BMI及有無吸煙史的表達量差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 觀察組不同臨床特征中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16表達的差異

2.4 觀察組中miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16的相關性 應用Pearson相關分析顯示，觀察組中miR-340-3p和CXCL-13(r=-0.634,P=0.032)、miR-340-3p和CXCL-16(r=-0.620,P=0.022)均呈負相關性，CXCL-13和CXCL-16(r=0.614,P=0.014)呈正相關性。

2.5 生物信息分析 先利用miRNAs靶基因預測網站Targetscan Human 7.2(http://www.targetscan.ort/vert_72)進行預測，篩選出miR-340-3p的全部靶基因。將全部靶基因輸入DAVID 6.8(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)的生物信息分析網站(https://david.ncifcrf.gro/home.jsp)，用GO生物學功能富集分析及KEGG信號通路分析，篩選相關的靶基因。將兩組靶基因輸入Venny2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，找到交集基因。結果顯示miR-340-3p與CXCL-13、miR-340-3p與CXCL-16有可能結合的位點。

3 討 論

急性胰腺炎的發生是多種生物學因子參與的疾病，多種研究顯示其發生有炎性調控機制、遺傳機制及免疫性機制等[7-8]。趨化因子是與炎性調控相關的一組細胞因子，是一類對靶細胞有趨化作用的細胞因子，能與表達靶基因的細胞膜上的相應受體結合，促進靶細胞的遷移而表現出特異的生物學效應[9-10]。CXCL-13基因定位于4q21上，其氨基酸序列與小鼠有約2/3的同源性，在人體主要分布在肝、脾、淋巴結和胃中[11]。CXCL-16在人體主要分布在肺、肝、小腸及腎臟，兩者主要表達在單核巨噬細胞、樹突狀細胞、內皮細胞，均包含跨膜區和黏蛋白樣結構，具有分泌型和結合型兩種形式。CXCL-13、CXCL-16在人正常胰腺組織中的表達量極低[12-13]。也有研究認為急性胰腺炎病變形成時細胞因子的表達量增加，是炎性反應的瀑布效應結果，其中有關的信號因子較多，也包括miRNA的靶向調控作用調節因子[14-15]。miRNA是復雜的信號調控網絡的重要部分，其經典方式是作為上游因子對下下游靶基因進行調控而發揮生物學特性[16]。miRNA發生改變時，下游多種因子也發生改變這能使mRNA 的翻譯功能發生改變[17]。本實驗篩選出的miR-340-3p具有調控炎癥及腫瘤細胞增殖的多重作用。

本研究結果顯示miR-340-3p在急性胰腺炎患者血清中的表達量明顯降低，CXCL-13和CXCL-16的表達量明顯增高，提示miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16的異常表達狀態是急性胰腺炎病變形成過程中的重要分子事件。結果顯示miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16在急性胰腺炎的不同病變分級中的表達差異有統計學意義，即miR-340-3p在重癥患者的表達量更低，CXCL-13和CXCL-16在重癥患者表達更高，提示miR-340-3p、CXCL-13和CXCL-16與病變分級程度密切相關，也提示檢測三者的表達可能與病變分級相關，可能是預測病變分級的客觀指標。結果顯示miR-340-3p與CXCL-13、miR-340-3p與CXCL-16均具有負相關性，且經生物信息預測并發現有相關結合位點，提示其具有負向協同作用?；罨蟮腃XCL-13對胰腺上皮細胞及間質細胞的損傷有明顯的促進作用。有研究認為CXCL-16表達升高，能促進細胞內炎性小體的表達，使其活性增強；也有學者發現CXCL-16的表達增加常伴隨著氧自由基的產生，使局部組織和細胞發生損傷[18]。有學者探究手術后腦膜炎患者腦脊液中CXCL-13的水平，發現CXCL-13在術后并發腦膜炎患者腦脊液中水平明顯升高，認為其不僅影響腦膜炎的進程，還對于篩查術后并發腦膜炎患者有一定價值[19]。miR-340-3p下降在機體中的作用途徑可能更多，如調節白細胞的“胞吞”作用、減弱巨噬細胞的活化等，使損傷因子的清除能力增強[20]。也有研究認為miR-340-3p的效應因子是長非編碼RNA 反義RNA，因此基于miR-340-3p在炎癥中進行深入研究對探討炎癥形成的分子機制可能有重要價值。急性胰腺炎在疾病發展時細胞和組織形成多種炎性細胞因子[21]，部分因子如IL-18等能通過NO依賴途徑加速表面上皮的損傷，并引起纖維細胞等間質細胞成分的改變。但是miR-340-3p與CXCL-13、miR-340-3p與CXCL-16的具體靶向調控作用尚需要體外行雙熒光素酶等基礎實驗進一步證實。

總之，急性胰腺炎患者血清中miR-340-3p低表達、CXCL-13和CXCL-16高表達，miR-340-3p與CXCL-13、miR-340-3p與CXCL-16具有負向協同作用，參與病變的形成和進展。