頂空-氣相色譜法與氫氣微電極法用于富氫水中氫氣含量的檢測

劉伯言，賈修濱，薛俊莉，秦樹存

（山東第一醫科大學第二附屬醫院，泰山氫生物醫學研究院，山東泰安 271000）

氫氣在常溫常壓下為無色無味氣體，其分子量小，在體內可無障礙地透過各種屏障進入細胞內部[1-2]。2007年，有學者發現吸入低濃度的氫氣在體內可中和毒性自由基，減少缺血再灌注損傷[3]。之后，氫氣的生物醫學效應得到了廣泛關注。從基礎研究到臨床治療，氫氣在呼吸系統疾病、代謝性疾病、衰老相關疾病等多個領域嶄露頭角[4-8]。氫氣用于人體的安全性體現在多個方面：首先，氫氣是人體腸道菌群的正常代謝產物[9-10]。同時，在潛水醫學領域氫氣早已應用于人體，沒有發現任何的毒性反應及不良后果[11]。在氫氣醫學迅速發展的近十幾年中，大量的臨床試驗也未發現氫氣的毒副作用[12-14]。更多高質量的氫氣安全性和有效性數據有待科學家們進一步收集分析。在我國，氫氣已被認可作為食品添加劑，出現在正式頒布的國家標準中[15]，在日本[16]、歐盟[17]、美國[18]，氫氣也被列為安全的食品添加劑。作用于人體的氫氣供體多種多樣，主要包括吸入不同濃度氫氣、飲用富氫水、氫水沐浴等[12,19-20]，其中飲用富氫水是較為常見的一種方式[21]。

富氫水即含有氫氣的水，其制備及儲存方式有多種，氫氣含量為評價富氫水的最關鍵指標之一[22-23]。在常溫常壓下飽和氫氣水溶液中氫氣含量約為1.61 mg/L，通過微氣泡等技術，可以使水中不僅有溶解狀態的氫氣，也有微氣泡狀態的氫氣，從而提高了富氫水中的氫氣含量[24]。目前水中氫氣含量的檢測方法有氣相色譜法、氫氣微電極法、亞甲藍氧化還原滴定法等[25-27]。文獻中已有相關檢測方法的報道，但檢測對象均為實驗室中充入氫氣的水，對市面上的富氫水產品或超飽和富氫水中氫氣含量檢測尚無報道。這些方法是否適合目前富氫水產品中氫氣含量的檢測尚無系統研究。氣相色譜法檢測從富氫水中釋放出來的氫氣，對于含微氣泡的超飽和富氫水，可以通過加熱等方式促進氫氣的釋放。氫電極法適用于檢測溶解于水中的氫氣，其測量范圍為飽和濃度以下，目前市面上很多富氫水為超飽和的微氣泡富氫水，本文通過稀釋的方式使氫氣濃度至飽和以下并完全溶解。亞甲藍氧化還原滴定法通過納米鉑催化氫氣還原亞甲藍，根據亞甲基藍的用量得到水溶液中氫氣的含量[28]。此法方便快捷，但較為粗略，無法準確定量。

在我國，富氫水產品尚未制訂國家標準和行業標準，目前僅有團體標準T/NAHIEM 16-2019《含氫包裝飲用水》[29]，其中提到“產品保質期內，氫氣含量不低于0.6 mg/L”，在氫氣含量檢驗中提到“氫氣的含量使用氣相色譜法進行測定（對氫濃度的檢測也可采用與氣相色譜法精度相當的檢測方法）”，但具體檢測流程尚未制定。為規范相關市場，推進行業發展，建立標準的富氫水中氫氣含量檢測方法刻不容緩?？梢远繖z測富氫水中氫氣含量的方法主要為頂空-氣相色譜法和氫氣微電極法。本文對兩種檢測方法進行了方法學驗證，建立了可用于實際富氫水產品中氫氣含量的檢測方法，并檢測了市面罐裝富氫水中氫氣含量，可以為相關應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

20 mL頂空瓶 美國Agilent公司；超純水 密理博Milli-Q超純水機；7種市售罐裝富氫水 （產品1，生產日期：2022-02-25，1.5 mg/L＜標注濃度＜2 mg/L；產品2，生產日期：2022-02-26，2.5 mg/L＜標注濃度≤3 mg/L；產品3，生產日期：2022-01-25，1.5 mg/L＜標注濃度＜2 mg/L；產品4，生產日期：2021-11-24，2.5 mg/L＜標注濃度≤3 mg/L；產品5，生產日期：2021-11-23，2 mg/L≤標注濃度≤2.5 mg/L；產品6，生產日期：2022-01-19，2 mg/L≤標注濃度≤2.5 mg/L；產品7，生產日期：2022-01-19，1.5 mg/L＜標注濃度＜2 mg/L）。

8890氣相色譜儀配熱導檢測器、7697A頂空進樣器、GS-CarbonPLOT毛細管柱（30 m×3 μm，0.32 mm） 美國Agilent公司；微電極系統（配有H2-50氫氣微電極） 丹麥Unisense公司；SPE-300純水氫氣發生器 濟南浩偉實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 氫氣標準水溶液的制備 在20 ℃，標準大氣壓（101 kPa）下將氫氣發生器制備的高純度氫氣（＞99.99%）經分散器充入超純水中直到飽和。查閱文獻可知此時水中氫氣濃度約為805 μmol/L[30]，即1.61 mg/L。將此溶液用超純水稀釋，配制成濃度為0、0.161、0.322、0.805、0.966、1.449、1.610 mg/L的標準工作溶液。

1.2.2 頂空-氣相色譜檢測 色譜柱：GS-Carbon-PLOT毛細管柱（30 m×3 μm，0.32 mm）；載氣（N2）流速3.0 mL/min；進樣口溫度200℃，分流比20:1；柱溫35 ℃，檢測器溫度: 200 ℃。頂空條件：樣品平衡時間20 min；頂空瓶溫度70 ℃；定量環溫度80 ℃；傳輸線溫度80 ℃；進樣時間0.5 min。取5 mL標準工作液置于20 mL頂空瓶中，立即封閉后檢測，得到標準曲線。將待測富氫水用超純水稀釋至標準曲線范圍內（氫氣濃度＜1.61 mg/L），取5 mL稀釋后樣本置于20 mL頂空瓶中檢測。根據標準曲線計算稀釋后樣本中氫氣含量，并乘以稀釋倍數得到原始樣本中氫氣含量。

1.2.3 氫氣微電極檢測 氫氣微電極極化電壓為100 mV，將氫氣微電極插入超純水中，待電極信號穩定后開始進行檢測。極化時間約為2 h。取10 mL標準工作液于50 mL離心管中，立即將氫氣微電極插入液面以下待信號穩定，得到標準曲線。將待測富氫水用超純水稀釋至標準曲線范圍內（氫氣濃度＜1.61 mg/L），取10 mL稀釋后樣本檢測，根據標準曲線計算稀釋后樣本中氫氣含量，并乘以稀釋倍數得到原始樣本中氫氣含量。

1.2.4 罐裝富氫水產品中氫氣含量檢測 開蓋后立即取適量體積富氫水用超純水稀釋至標準曲線范圍內（氫氣濃度＜1.61 mg/L），根據1.2.2和1.2.3中的方法分別檢測罐裝富氫水產品中氫氣含量。檢測日期均為2022年3月，各產品均在保質期內。對于產品1和產品2，采用氫氣微電極法檢測開蓋后8.3 h內定時取樣，檢測氫氣含量隨時間變化情況。

1.3 數據處理

相關實驗重復3次，數據用均值±標準差表示。2組之間檢測結果使用獨立樣本t檢驗分析顯著性差異。采用使用SPSS 20 及 Origin 8.5 軟件進行數據分析及圖形繪制。

2 結果與分析

2.1 頂空-氣相色譜法

2.1.1 頂空進樣平衡溫度與時間的優化 對于水中氫氣的檢測，分子篩毛細管柱會受到水蒸氣的影響，本研究采用GS-CarbonPLOT毛細管柱。圖1A為單純氫氣進樣色譜圖，圖1B為富氫水樣本檢測色譜圖?？芍獨錃獬龇鍟r間為1.22 min。在該色譜條件下，色譜圖基線穩定，氫氣峰能夠分離，并且無拖尾等現象。

圖1 氫氣（A）及富氫水樣本（B）頂空進樣色譜圖Fig.1 Chromatogram of headspace sampling of hydrogen (A)and hydrogen-rich water sample (B)

氣相色譜法檢測的前提是將水中的氫氣釋放出來，這就需要采用頂空的前處理方法。選取同一濃度（氫氣0.805 mg/L）樣品，考察了頂空進樣的不同平衡溫度（40、50、60、70、80 ℃）和不同平衡時間（5、10、15、20、30 min）對測定結果的影響。結果表明：平衡時間為15 min時，隨著平衡溫度的升高，氫氣峰面積相應遞增，當溫度超過70 ℃，目標物的峰面積增加緩慢，且溫度過高會影響頂空瓶氣密性，故實驗選擇70 ℃作為平衡溫度（圖2A）；平衡溫度為70 ℃時，隨著平衡時間增加，5～20 min目標物的峰面積逐級遞增并趨于平穩，之后峰面積才基本不再增加（圖2B）。故實驗選擇頂空進樣的平衡溫度和平衡時間分別為70 ℃和20 min。

圖2 頂空平衡溫度（A）和平衡時間（B）對氫氣峰面積的影響Fig.2 Effects of equilibrium temperature (A) and time (B) on hydrogen peak area

2.1.2 線性關系、檢出限和定量限 在優化后的條件下，將0、0.161、0.322、0.805、0.966、1.449、1.610 mg/L梯度標準工作溶液使用頂空-氣相色譜法進行檢測，以峰面積（Y）為縱坐標，氫氣濃度（X，mg/L）為橫坐標進行回歸運算，得到頂空-氣相色譜法回歸方程為Y=19.38X+0.9595，R2=0.9976。在0～1.610 mg/L范圍內本方法具有良好的線性關系（圖3A）。以3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限，得檢出限為0.0036 mg/L，定量限為0.012 mg/L。

圖3 頂空-氣相色譜法（A）和氫氣微電極法（B）檢測水中氫氣含量標準曲線Fig.3 Standard curve of hydrogen concentration detection in water by headspace gas chromatography (A) and hydrogen microsensor (B)

2.1.3 準確度和精密度 配制氫氣濃度為0.1613、0.805、1.449 mg/L的標準溶液進行檢測，每個濃度在優化后條件下平行測定6次，通過回收率來考察方法的準確度，通過相對標準偏差（RSD）來考察方法的精密度，測定結果如表1所示。實驗結果表明，在0.161、0.805、1.449 mg/L添加水平，回收率分別為104.90%、102.22%和97.78%，說明準確度良好。RSD分別為3.87%、2.29%和1.69%，均小于5%，說明精密度良好（表1）。

表1 頂空-氣相色譜法的準確度及精密度Table 1 Accuracy and precision of the detection by headspace gas chromatography

2.2 氫氣微電極法

2.2.1 線性關系、檢出限和定量限 將0、0.161、0.322、0.805、0.966、1.449、1.610 mg/L梯度標準工作溶液使用氫氣微電極法進行檢測，以信號強度（Y）為縱坐標，氫氣濃度（X，mg/L）為橫坐標進行回歸運算，得到氫氣微電極法回歸方程為Y=1297X-22.98，R2=0.9978。在0～1.610 mg/L范圍內本方法均具有良好的線性關系（圖3B）。以3倍信噪比為檢出限，10倍信噪比為定量限，得檢出限為0.00023 mg/L，定量限為0.00077 mg/L。

2.2.2 準確度和精密度 對氫氣濃度為0.1613、0.805 、1.449 mg/L標準溶液使用氫氣微電極法進行檢測，平行測定6次。如表2所示，在0.161、0.805、1.449 mg/L添加水平，回收率分別為96.75%、95.78%和98.00%，說明準確度良好。相對標準偏差（RSD）分別為1.84%、0.98%和2.80%，均小于5%，說明精密度良好（表2）。

表2 氫氣微電極法的準確度及精密度Table 2 Accuracy and precision of the detection by hydrogen microsensor

2.3 實際樣品檢測

對市售7種罐裝富氫水（編號1～7），每種3個樣品（01～03），使用2種方法進行測試。結果見表3?？梢钥闯?，市面上罐裝富氫水氫氣含量均達到了團體標準T/NAHIEM 16-2019《含氫包裝飲用水》中規定的0.6 mg/L，但不同品牌產品氫氣含量相差很大，從0.8至6.2 mg/L不等。富氫水中的氫氣在暴露于空氣之中后易于散發[31]，在產品開蓋后氫氣存留情況如何，也是一個值得關注的指標。本實驗以氫氣含量最高的產品（產品1和產品2）為代表，得到了在開蓋后富氫水氫氣含量隨時間變化情況。由圖4可知，在開始階段氫氣散失速度較快，之后逐漸減緩。對于初始濃度約為3 mg/L的富氫水產品，開蓋后5 h內仍然在氫氣水溶液飽和濃度之上；對于初始濃度約為6 mg/L的富氫水產品，開蓋后8 h內仍然可達到2.2 mg/L以上，遠超過飽和氫氣濃度?？傮w來說，開蓋后超飽和富氫水中氫氣存留量在30 min內降低約10%，6 h內約降低一半。

圖4 罐裝富氫水產品開蓋后水中氫氣含量隨時間變化情況Fig.4 Hydrogen concentration of different hydrogen-rich water products after opening cover over time

表3 樣品檢測結果Table 3 Measurement result of the sample

3 討論與結論

隨著氫氣的生物醫學效應和機制研究的深入，氫氣相關健康產品也越來越多，富氫水是其中重要的產品之一，氫氣含量是富氫水的關鍵指標。本文建立了富氫水中氫氣含量的檢測方法，并對市面上的罐裝富氫水進行了檢測。在樣本的前處理方面，對于超飽和的富氫水，需通過稀釋的方式使氫氣含量在標準曲線范圍之內，即氫氣的飽和濃度1.61 mg/L以下。此外，氣相色譜法需通過頂空進樣的方式，使溶解于水中的氫氣釋放出來，因此增加了前處理的步驟。在檢測成本方面，氫氣微電極法設備和耗材的成本低于氣相色譜法。方法學考察結果表明，頂空-氣相色譜法與氫氣微電極法在0～1.61 mg/L氫氣含量范圍內均有良好線性關系，在低、中、高三個添加水平下，回收率分別為97.78%～104.90%、95.78%～98.00%，相對標準偏差分別為1.69%～3.87%、0.98%～2.80%，均能夠滿足檢測要求。目前市面上罐裝富氫水產品標注的氫氣含量從1.6 ppm（約1.6 mg/L）到3 ppm（約3 mg/L）不等。通過對市面上7種罐裝富氫水進行檢測表明這些產品均達到團體標準規定的0.6 mg/L，但氫氣含量相差較大，不同產品甚至能相差近8倍。本文通過頂空-氣相色譜法和氫氣微電極法對富氫水中氫氣含量進行檢測，可以為相關應用及標準的制定提供參考。