遠志皂苷D通過Wnt/β-catenin信號通路抑制結直腸癌的生長和轉移

梁 義，李 健，白 波，孫成林，孫宏旭

0 引言

結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)是全球第3大常見惡性腫瘤，也是癌癥相關死亡的第2大原因[1-2]。在許多發展中國家，CRC的發病率和死亡率仍在迅速上升，預計到2030年，CRC的公共衛生負擔將增加60%，新確診的病例將超過220萬，死亡人數將達到110萬人[3]。隨著早期篩查的實施和規范化治療的進展，CRC患者的預后明顯改善，早期患者5年生存率接近90%，然而，由于缺乏明顯的早期癥狀以及早期發現和篩查的局限性，大多數CRC患者在晚期才被診斷出來，這些患者的預后仍很差，特別是有晚期疾病和遠處轉移的患者，其5年生存率僅為13.1%[4]。開發CRC治療的新藥物仍是必要的。桔梗是東亞各國廣泛應用的藥用植物，對肝細胞癌、胃癌、前列腺癌、小細胞肺癌和腎細胞癌等多種癌癥具有潛在的治療作用[5]。遠志皂苷D(Polygalacin D,PGD)是桔梗中的一種三萜皂苷，是桔梗的主要化學成分之一[6]。目前尚無其在結直腸癌治療中發揮作用的相關報道。本研究探究了PGD對CRC細胞體外增殖、遷移和侵襲及體內腫瘤生長的作用，并分析其機制，為CRC治療藥物的開發提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器 遠志皂苷D(美國MCE公司)；DMEM高糖培養基、胎牛血清和Lipofectamine 3000轉染試劑(美國Thermo公司)；PCDNA3.1 β-catenin過表達質粒(上海吉瑪制藥技術有限公司)；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、ECL發光試劑盒和CCK-8增殖檢測試劑盒(上海碧云天生物科技公司)；p-GSK3β、β-catenin、cyclinD1、c-Myc、GAPDH和Ki-67抗體(美國Abcam公司)；山羊抗兔二抗(美國Abcam公司)；酶標儀(美國Thermo公司)；光學顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；熒光顯微鏡(日本尼康公司)；化學發光成像系統(上海天能生物公司)；低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)。

1.2 細胞培養及轉染 結直腸癌SW620細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基在37 ℃含5%二氧化碳的恒溫培養箱中培養。細胞轉染嚴格按照Lipofectamine 3000轉染試劑說明書進行。

1.3 CCK-8檢測不同濃度PGD對結直腸癌細胞增殖的影響 將結直腸癌SW620細胞均勻鋪板于96孔板中，培養過夜后，各孔分別加入0、1.25、2.5、5、10、15、20、25、30、40、50、60 μM PGD處理細胞，繼續培養24 h，棄培養基，加入110 μl CCK-8檢測試劑(含10 μl CCK-8)，37 ℃孵育1 h，酶標儀檢測450 nm吸光度值。

1.4 Transwell檢測不同濃度PGD對結直腸癌細胞遷移和侵襲的影響 將結直腸癌SW620細胞分別加入基質膠不包被(遷移實驗)或包被(侵襲實驗)的Transwell小室上室中，細胞分為4組：對照組、PGD低劑量組(PGD-L組)、PGD中劑量組(PGD-M組)和PGD高劑量組(PGD-H組)，分別加入0、15、25、40 μM PGD，上室加入無血清培養基，下室加入含20%胎牛血清的培養基，繼續培養48 h后，甲醛固定，1 %結晶紫染色30 min，光學顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 Western blot 將結直腸癌SW620細胞分為4組：對照組、PGD低劑量組(PGD-L組)、PGD中劑量組(PGD-M組)和PGD高劑量組(PGD-H組)，分別加入0、15、25、40 μM PGD，繼續培養24 h后，收集細胞，加入RIPA裂解液，冰上孵育30 min，超聲破碎儀冰上破碎3次，4 ℃ 12 000轉/min離心20 min，BCA法檢測蛋白濃度，根據蛋白濃度配置蛋白樣品，沸水煮樣5 min使蛋白充分變性，將變性的蛋白樣品加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠上樣孔中進行電泳，將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，p-GSK3β、β-catenin、cyclinD1、c-Myc和GAPDH抗體4 ℃孵育過夜，PBST洗膜3次，山羊抗兔二抗室溫孵育1 h，PBST洗膜3次，ECL法發光，Image J計算條帶灰度值。

1.6 裸鼠成瘤 將結直腸癌SW620細胞皮下注射BALB/c nude裸鼠，將裸鼠隨機分為對照組和PGD組，PGD組瘤內注射PGD(10 mg/kg)，對照組注射等量生理鹽水，從皮下注射細胞后第3天開始，每隔3 d注射1次，于皮下注射細胞后第22天，脫頸椎法處死裸鼠，取腫瘤組織，測量腫瘤體積及瘤重。通過免疫熒光檢測腫瘤組織Ki-67表達，具體步驟為將腫瘤組織置于4%多聚甲醛中，室溫固定6 h，轉移至20%蔗糖中至組織沉底，包埋并冰凍組織塊，恒溫冰凍切片機將組織切成厚8 μm的冰凍切片，室溫放置30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，Ki-67一抗4 ℃孵育過夜，PBS洗滌3次，每次5 min，熒光二抗室溫避光孵育1 h，PBS洗滌3次，每次5 min，DAPI染色液室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，抗熒光淬滅封片劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。取移植瘤組織并剪碎，加入RIPA裂解液，組織勻漿機冰上勻漿3次，冰上孵育30 min，通過Western blot檢測腫瘤組織p-GSK3β、β-catenin、cyclinD1、c-Myc和GAPDH蛋白表達，后續步驟與上述Western blot步驟一致。

1.7 CCK-8檢測過表達β-catenin對PGD處理的結直腸癌細胞增殖的影響 將結直腸癌SW620細胞均勻鋪板于96孔板中，細胞分為3組：對照組、PGD組、PGD+β-catenin組。PGD組和PGD+β-catenin組加入40 μM PGD處理24 h，PGD+β-catenin組在PGD處理前24 h嚴格按照Lipofectamine 3000轉染試劑說明書轉染β-catenin過表達質粒，PGD處理后，棄培養基，加入110 μl CCK-8檢測試劑(含10 μl CCK-8)，37 ℃孵育1 h，酶標儀檢測450 nm吸光度值。

1.8 Transwell檢測過表達β-catenin對PGD處理的結直腸癌細胞遷移和侵襲的影響 將結直腸癌SW620細胞分別加入基質膠不包被(遷移實驗)或包被(侵襲實驗)的Transwell小室上室中，細胞分為3組：對照組、PGD組、PGD+β-catenin組，PGD組和PGD+β-catenin組加入40 μM PGD處理24 h，PGD+β-catenin組在加入上室前嚴格按照Lipofectamine 3000轉染試劑說明書轉染β-catenin過表達質粒，上室加入無血清培養基，下室加入含20%胎牛血清的培養基，繼續培養48 h后，甲醛固定，1 %結晶紫染色30 min，光學顯微鏡下觀察并拍照。

2 結果

2.1 PGD抑制結直腸癌細胞增殖 CCK-8結果顯示，與0 μM相比，5 μM、10 μM、15 μM、20 μM、25 μM、30 μM、40 μM、50 μM和60 μM PGD處理的SW620細胞增殖活性顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；PGD處理SW620細胞的IC50值為25.11 μM。見圖1。

圖1 不同濃度PGD對CRC細胞活性增殖的影響(n=3)注：PGD：遠志皂苷D；CRC：結直腸癌。*與 0 μM組比較，P<0.05

2.2 PGD抑制結直腸癌細胞遷移和侵襲 Transwell遷移實驗結果顯示，與對照組相比，PGD-L組、PGD-M組和PGD-H組SW620細胞穿膜細胞數顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；Transwell侵襲實驗結果顯示，與對照組相比，PGD-L組、PGD-M組和PGD-H組SW620細胞穿膜細胞數顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2。

2.3 PGD抑制結直腸癌細胞Wnt/β-catenin信號通路 Western blot結果顯示，與對照組相比，PGD-L組、PGD-M組和PGD-H組SW620細胞p-GSK3β(S9)、β-catenin、cyclinD1和 c-Myc蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 PGD抑制結直腸癌細胞移植瘤腫瘤生長 裸鼠成瘤實驗結果顯示，與對照組相比，PGD組SW620細胞移植瘤變小，腫瘤體積和瘤重顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

2.5 PGD抑制結直腸癌細胞移植瘤Ki-67表達 免疫熒光結果顯示，與對照組相比，PGD組SW620細胞移植瘤Ki-67表達顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖5。

2.6 PGD抑制結直腸癌細胞移植瘤Wnt/β-catenin信號通路 Western blot結果顯示，與對照組相比，PGD組SW620細胞移植瘤p-GSK3β(S9)、β-catenin、cyclinD1和 c-Myc蛋白表達水平顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖6。

圖2 不同濃度PGD對CRC細胞遷移和侵襲的影響(n=3)注：PGD：遠志皂苷D；CRC：結直腸癌。*與對照組比較，P<0.05

圖3 不同濃度PGD對CRC細胞Wnt/β-catenin通路相關蛋白表達的影響(n=3)注：PGD：遠志皂苷D；CRC：結直腸癌。*與對照組比較，P<0.05

圖4 PGD對CRC細胞移植瘤腫瘤生長的影響(n=3)注：PGD：遠志皂苷D；CRC結直腸癌。*與對照組比較，P<0.05

圖5 PGD對CRC細胞移植瘤Ki-67表達的影響(n=3)注：PGD：遠志皂苷D；CRC：結直腸癌。*與對照組比較，P<0.05

圖6 PGD對CRC細胞移植瘤Wnt/β-catenin信號通路的影響(n=3)注：PGD：遠志皂苷D；CRC結直腸癌。*與對照組比較，P<0.05

2.7 PGD通過Wnt/β-catenin信號通路抑制結直腸癌細胞增殖 CCK-8結果顯示，與對照組相比，PGD組SW620細胞增殖活性顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與PGD組相比，PGD+β-catenin組SW620細胞增殖活性顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖7。

圖7 PGD通過Wnt/β-catenin信號通路抑制CRC細胞增殖(n=3)注：PGD：遠志皂苷D；CRC結直腸癌。*與對照組比較，P<0.05;#與PGD組比較，P<0.05

2.8 PGD通過Wnt/β-catenin信號通路抑制結直腸癌細胞遷移和侵襲 Transwell遷移實驗結果顯示，與對照組相比，PGD組SW620細胞穿膜細胞數顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與PGD組相比，PGD+β-catenin組SW620細胞穿膜細胞數顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)；Transwell侵襲實驗結果顯示，與對照組相比，PGD組SW620細胞穿膜細胞數顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與PGD組相比，PGD+β-catenin組SW620細胞穿膜細胞數顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖8。

3 討論

CRC是一種常見的癌癥，約占全球所有癌癥的10%，目前是世界上第三大常見的男性癌癥和第二大常見的女性癌癥[7]。CRC通常起源于腸壁并涉及結腸、直腸和闌尾[8]。手術切除、化療和放療是目前CRC患者的主要治療策略，其中早期癌癥患者優先考慮手術切除，而放化療則是疾病晚期的治療方式[9]。轉移是CRC患者高死亡率的主要原因[10]。開發抑制CRC轉移的相關治療藥物是必要的。桔梗是桔?？频囊环N植物，其干根在中藥中用于調節肺經，具有潤肺、化痰、排膿的作用，是治療咽喉痛、化膿性癰感染嘔吐、胸脅痛等證候的主要藥物[11]。PGD是一種三萜皂苷，是桔梗的主要化學成分之一[12]。Xiao等[13]的研究結果顯示，PGD顯著降低了食管鱗狀細胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)細胞增殖，并誘導G2/M細胞周期阻滯、凋亡及自噬，此外，其還抑制ESCC細胞的遷移和侵襲[13]。Seo等[6]的研究發現，PGD誘導非小細胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)細胞凋亡和G0/G1期阻滯。本研究結果顯示，PGD在體外劑量依賴性地抑制CRC細胞增殖、遷移和侵襲，并在體內抑制CRC細胞腫瘤生長，表明PGD在CRC中發揮抗癌作用。

圖8 PGD通過Wnt/β-catenin信號通路抑制CRC細胞遷移和侵襲(n=3)注：PGD：遠志皂苷D；CRC結直腸癌。*與對照組比較，P<0.05;#與PGD組比較，P<0.05

Wnt/β-catenin信號通路是一個保守的信號轉軸，參與增殖、分化、凋亡、遷移、侵襲和組織穩態等多種生理過程，其失調促進一些實體腫瘤和血液系統惡性腫瘤的發生和發展[14]。Wnt/β-catenin信號通路通過調節β-catenin的水平來調節關鍵發育基因的表達，β-catenin在轉錄調節和染色質相互作用中作為細胞內信號轉換器，糖原合成酶激酶(Glycogen synthase kinase,GSK)-3β和酪蛋白激酶1α(Casein kinase 1α,CK1α)介導β-catenin的磷酸化，促進其泛素化和隨后的蛋白酶體降解，GSK-3β磷酸化促進β-catenin在細胞核中的積累和核異位，從而促進其下游靶基因表達[15]。研究表明，PGD可抑制NSCLC中GSK-3β磷酸化[6]。本研究結果顯示，PGD抑制CRC細胞及移植瘤中p-GSK3β、β-catenin、cyclinD1和 c-Myc蛋白表達，此外，過表達β-catenin促進PGD處理的CRC細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，本研究發現，PGD在體外抑制CRC細胞增殖、遷移和侵襲，且在體內抑制CRC細胞移植瘤腫瘤生長，這可能與其抑制GSK-3β磷酸化,從而抑制Wnt/β-catenin信號通路激活有關。因此，PGD有望成為CRC治療的有效藥物。