動物源食品中抗生素殘留檢測方法與研究進展

付海燕,盧歡歡,龍婉君,佘遠斌

1.中南民族大學 藥學院,湖北 武漢 430074;2.浙江工業大學 化學工程學院,浙江 杭州 310014

0 引言

抗生素類藥物具有抑制或殺滅微生物的作用,不僅可以預防和治療人類及畜禽細菌感染等疾病,還可用作飼料添加劑[1],在畜牧業中得到廣泛應用[2]。然而,有些不良商家為追求養殖利益濫用抗生素,造成畜禽體內抗生素殘留超標。此外,畜禽自身僅能吸收少量的抗生素[3],30%～90%的抗生素會以母體或者代謝產物的形式被排入周圍環境中,造成一定程度的環境污染[4]。無論是畜禽體內殘留還是排入環境,抗生素最終都會經食物鏈直接或間接地進入人體,危害人類健康?？股卦隗w內累積不僅可導致過敏反應、關節病變、胃腸道不適、肝和中樞神經損害等[5],還存在致畸、致癌、致突變等潛在風險。值得注意的是,若人體產生耐藥性,會給相關疾病的治療帶來更大困難[6]。近年來,在肉類[7]、奶制品[8]、水體[9]中抗生素殘留超標的情況屢見不鮮,面對這一嚴峻現狀,我國農業農村部、國家衛生健康委員會、國家市場監督管理總局已多次發布公告和標準[10-13],針對食品中獸藥最大殘留限量及食品動物禁用抗生素種類均做了明確規定。目前,動物源食品中抗生素殘留檢測的研究越來越受到業界重視,但現有的檢測方法存在分析時間較長、難以實現多種類型抗生素同時檢測等問題。因此,開發快速且準確的抗生素檢測方法對于保障食品安全至關重要。本文擬從動物源食品中抗生素的主要類型、殘留現狀、檢測方法、檢測難點等方面進行綜述,以期為抗生素檢測方法的開發及應用提供參考。

1 動物源食品中抗生素主要類型

1.1 氟喹諾酮類

氟喹諾酮類(Fluoroquinolones, FQs)抗生素是一類人畜通用抗生素,因含有喹諾酮結構而得名,具有抗菌譜廣、抗菌效果好等優勢,在醫療和養殖業中得到廣泛應用。該類抗生素可以抑制細菌DNA旋轉酶和拓撲異構酶活性,從而起到殺菌作用[14]。FQs抗生素主要有氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星等,其中,諾氟沙星、環丙沙星和氧氟沙星的使用量可達98%[15]。然而,進入禽畜體內的FQs抗生素僅有30%可被吸收,大多殘留物都會以原型或代謝物的形式被排出體外,最終進入到環境中[16]。人體長期攝入FQs抗生素會引發神經系統損傷,這主要是因為FQs抗生素可抑制腦內抑制性神經遞質γ-氨基丁酸與受體結合,使中樞神經興奮性增高,甚至導致痙攣和癲癇的發作[17]。

1.2 β-內酰胺類

β-內酰胺類(β-lactams, BLAs)抗生素的結構中均具有β-內酰胺基母核,是目前臨床上使用最多的一類抗生素[18],主要包括青霉素類、頭孢菌素類等。BLAs抗生素能抑制細菌黏肽轉肽酶活性,阻斷細菌細胞壁的合成,從而起到殺菌作用[19]。近年來,由于該類抗生素的濫用,導致環境中出現了大量的抗生素耐藥菌和抗生素耐藥基因(Antibiotic Resistance Genes,ARG)[20]。其中,ARG可以通過動物源性食品轉移到人體內,對人類健康造成威脅[21]。此外,人體長期攝入BLAs抗生素會破壞腸道的正常菌群環境,導致人體免疫力降低。

1.3 大環內酯類

大環內酯類(Macrolides, MA)抗生素是一種含有2個脫氧糖分子和14～16個碳原子的大脂肪族內酯環堿性藥物[22]。MA抗生素可以與細菌核糖體的50 S亞基發生不可逆結合,阻斷轉肽和mRNA的位移,從而有選擇地抑制蛋白質的合成,起到殺菌作用[23]。常見的MA抗生素有紅霉素、吉他霉素、阿奇霉素等,這類抗生素既可用作藥物,也可作為生長促進劑用于提高養殖業經濟效益[24]。目前,由于缺少有效的監管,導致MA抗生素濫用的情況十分普遍,而未被代謝的抗生素最終也會進入環境中[25]。人體長期攝入MA抗生素會過度刺激胃動素受體,對胃腸道產生副作用,從而引發腹部絞痛、惡心、嘔吐、腹瀉等癥狀[26]。

1.4 四環素類

四環素類(Tetracyclines, TCs)抗生素的主體母核為氫化駢四苯,取代基的種類決定了該類抗生素的種類。常見的TCs抗生素有土霉素、金霉素、多西環素等[27]。TCs抗生素是我國畜禽養殖業中使用較廣泛的抗生素之一,具有廉價、高效、抗菌譜廣等優點[28]。然而,TCs抗生素的累積及細菌耐藥性的產生,會對人類健康產生潛在威脅。有研究[29-30]表明,過量服用TCs抗生素會產生毒副作用或引起相關疾病,如四環素牙、惡心嘔吐、過敏反應等,其中以四環素牙較為常見,這主要是由于TCs抗生素進入人體后,易堆積于骨、牙齒和肝臟組織中,長期滯留在牙釉質及下層鈣化區而將牙齒染黃。此外,過量TCs抗生素殘留排入環境中會抑制環境微生物生長,對生態環境造成一定程度的破壞[31]。

1.5 硝基呋喃類

硝基呋喃類(Nitrofurans, NFs)抗生素是在呋喃核的5位引入硝基和2位引入其他基團而人工合成的抗菌藥。常見的NFs抗生素有呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃妥因等[32]。研究[33-34]表明,NFs抗生素中呋喃環5位上的硝基與致癌性密切相關,長期或者大劑量使用NFs抗生素會對人體產生較大的毒副作用,存在致癌、致畸和誘導基因突變的潛在風險。自1995年起,歐盟禁止硝基呋喃類藥物在畜禽及水產動物食品中使用[35]。2002年我國農業部及2020年農業農村部均發布公告,明令禁止NFs抗生素在所有食品動物飼料中的使用[10,36]。

1.6 磺胺類

磺胺類(Sulfonamides, SAs)抗生素是以對位氨基苯磺酰胺為基本結構的衍生物[37],具有成本低、抗菌譜廣等優點,其生產和消費量呈逐年穩定增長趨勢。然而,過度使用會導致殘留的SAs抗生素通過多種途徑進入環境中,據估計,每年有超過2×104t的SAs抗生素進入全球環境中[38]。在其他污染因素的聯合作用下,SAs抗生素的生物降解會受到抑制,從而產生細菌耐藥性并出現耐藥基因[39]。當SAs抗生素進入人體后,其代謝產物會形成晶體,對人體泌尿系統造成損傷[40]。

1.7 酰胺醇類

酰胺醇類(Amphenicols)抗生素的化學結構中均含有二氯乙酰胺基團,常見的種類有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考。該類抗生素的作用機制是與細菌70 S核糖體50 S亞基的A位點結合,抑制肽酰轉移酶的轉肽反應,阻止肽鏈延伸,從而抑制細菌蛋白質的合成[41]。其中,氯霉素因可能導致灰嬰綜合征、再生障礙性貧血等危害[42-43],已被我國禁止作為獸藥使用[10]。

1.8 氨基糖苷類

氨基糖苷類(Aminoglycosides, AGs)抗生素是由氨基糖分子與氨基環醇通過醚鍵連接而成的苷類抗生素[44],主要包括天然來源的鏈霉素、卡那霉素等,以及半合成的阿米卡星、依替米星等。AGs抗生素的抗菌機制主要通過干擾細菌蛋白質合成而發揮作用[45]。該類抗生素具有較強的耳毒性、腎毒性,其中,耳毒性主要表現為對第8對腦神經、前庭神經和耳蝸神經造成損害;腎毒性主要表現為對腎小管上皮細胞造成損害[46]。長期攝入AGs抗生素超標的食物將對人體產生巨大危害[47]。

2 動物源食品中抗生素殘留現狀及危害

在養殖業中,抗生素類藥物的不當使用會增加其在動物源食品中殘留的風險,當殘留的抗生素被人體攝入并累積,即使其質量濃度較低,也可能對人體健康產生負面影響[48]。因此,抗生素殘留已成為全球關注的重要問題。

2.1 動物源食品中抗生素殘留現狀

抗生素不僅可以預防和治療家禽疾病,還可用作飼料促進家禽生長。不良商家為賺取高額利益,在飼養家禽時濫用抗生素,導致動物源食品中抗生素殘留超標問題時常發生。在全球范圍內,常見肉類,例如雞肉[49]、牛肉[50]、豬肉[51]、水產海鮮[52]等均存在較嚴重的抗生素殘留現象。在黎巴嫩不同地區的雞肉樣本中篩查抗生素殘留,發現至少77.5%的樣本中存在抗生素殘留污染,薩拉沙星、阿莫西林和青霉素G的殘留水平均值均高于歐盟推薦的最大殘留限量(Maximum Residue Limit,MRL)[53]。在中國東南部抽樣10種淡水魚進行65種抗生素殘留的檢測,發現抗生素總檢出率為53.9%,其中3.48%的樣品中抗生素殘留超過MRL[54]。在我國長三角地區采集淡水養殖的3種水產品進行抗生素殘留的檢測,發現共有9種抗生素被檢出,檢出率為38.1%～90.5%,其中恩諾沙星和磺胺甲惡唑殘留較嚴重[55]。此外,2016—2019年,在我國湖北省采集雞肉和雞蛋進行9種FQs抗生素、4種TCs類抗生素和甲硝唑殘留的檢測,發現雞蛋中存在恩諾沙星、環丙沙星等抗生素,而雞肉中檢出了甲硝唑[56]。由此可見,目前動物源食品安全問題依然嚴峻,抗生素濫用造成的殘留超標問題應當引起全社會的重視。

2.2 動物源食品中抗生素殘留的危害

抗生素最常見的副作用之一是過敏反應。Q. WANG等[57-58]研究發現,青霉素可能會使皮膚產生過敏反應;TCs抗生素會導致過敏、皮疹和光毒性皮炎等特殊反應;MA抗生素可能使大環內酯代謝物修飾的肝細胞產生特異性過敏反應,導致肝損傷。近年來,耐藥性已成為抗生素造成的嚴重危害之一。人體通過食物鏈攝入的抗生素殘留可能會改變人體微生物菌群,促使人體耐藥細菌的出現,使人體產生抗生素耐藥性[59]。李振環等[60]研究表明,服用抗生素會使耐藥細菌在人體內穩定存在并持續數年,即使使用低劑量的抗生素,也可能導致耐藥性產生。目前,耐多藥細菌已經造成諸多感染性疾病治療困難,因此,抗生素耐藥性已成為一個嚴峻的公共衛生問題,預計到2050年,全球由耐藥性造成的死亡人數可能增至1000萬人,造成的經濟損失將達到100萬億美元[61]。

針對抗生素濫用這一嚴重問題,我國對一系列抗生素的使用進行了規范。2015年9月7日,我國農業部第2292號公告規定,禁止在食品動物中使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、諾氟沙星4種抗生素[11]。此外,還對各動物組織中其他抗生素殘留設定了MRL,例如,TCs抗生素的MRL為100～1200 μg/kg,紅霉素的MRL為40～200 μg/kg,等等[13]。

3 動物源食品中抗生素殘留檢測方法

3.1 色譜法

3.1.1 高效液相色譜法高效液相色譜(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)法具有選擇性好、分離效率高、適用面廣等優點,在化學、醫學、工業等多個學科領域中已經成為一種十分重要的分離和分析技術。在使用HPLC法對抗生素進行檢測時,常用的流動相為乙腈[62]和磷酸鹽溶液[63]。陳曉燕等[64]基于基質分散固相萃取-高效液相色譜-可變波長檢測法測定了鮮牛乳中氯霉素、呋喃唑酮等8種抗生素的含量,其中磺胺嘧啶、磺胺二甲氧嘧啶的檢出限低至0.18 μg/kg。

3.1.2 高效液相色譜-質譜聯用技術高效液相色譜-質譜(High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry,HPLC-MS)聯用技術具有靈敏度高、選擇性好、檢出限低等優點,是當前較為先進的抗生素殘留檢測方法[65]。我國農業部于2019年制定了采用LC-MS法檢測水產品中MA抗生素(紅霉素、克拉霉素、阿奇霉素、吉他霉素等)殘留的標準[66]。宮小明等[67]采用棉簽固相微萃取結合HPLC-MS聯用技術檢測蜂蜜中9種MA抗生素,其中螺旋霉素的檢出限低至0.24 μg/kg。

綜上可知,色譜法準確性好、靈敏度高、檢出限低,是目前國標規定的多種抗生素檢測的主要方法。但色譜儀器較昂貴、操作較復雜、耗時較長,無法滿足抗生素殘留快速檢測的需求。

3.2 光譜法

3.2.1 表面增強拉曼光譜法表面增強拉曼光譜(Surface-enhanced Raman Spectroscopy,SERS)法是一項新興的快速檢測技術,具有操作簡便、檢測速度快、準確率高等特點,已廣泛應用于抗生素的靈敏檢測。M.K.Jin等[68]提出了一種新穎、簡便、綠色、靈敏的中空纖維液相微萃取-SERS (HF-LPME-SERS)技術,并應用于雞蛋樣品中多種抗生素殘留的快速檢測,發現優化后的HF-LPME方法可直接從雞蛋樣品中提取抗生素,對氧氟沙星、磺胺二甲嘧啶、四環素等11種抗生素的最低檢出限為10 μg/kg。該方法的樣品操作簡便、成本低、靈敏度較高,可實現食品中痕量抗生素殘留的快速檢測。

3.2.2 三維熒光光譜法三維熒光光譜(Excitation-Emission-Matrix Spectra,EEMs)法具有簡便快捷、靈敏度高等優點,當其與化學計量學二階校正方法相結合時,借助二階校正方法的“二階優勢”,能夠在未知干擾存在時同時快速測定多個目標分析物。Y.Z.Ouyang等[69]建立了一種有效的化學計量學輔助分析策略,將EEMs與基于交替歸一加權殘差算法的二階校正方法相結合,并應用于動物源食品樣品(奶粉、牛奶和牛肉)中FQs抗生素的簡單快速檢測。與HPLC、LC-MS等復雜方法相比,該方法無需繁瑣的前處理步驟、嚴格的實驗條件和復雜的高成本儀器,可實現動物源食品基質中FQs抗生素快速、準確定量分析。

綜上可知,光譜法檢測時間短、樣品預處理簡單,但該方法的抗干擾能力較弱,而牛奶、奶粉、雞蛋、肉制品、蜂蜜等動物源食品基質背景較復雜,存在許多未知干擾,因此,該方法尚無法滿足市面上抗生素殘留精準檢測的需求。

3.3 電化學分析法

電化學分析(Electrochemical Analysis)法是基于電化學傳感器產生的可測量電信號實現檢測的方法[70],具有簡單、靈敏度高、實施成本低等優點,是目前抗生素檢測常用方法之一。H.S.Stevenson等[71]開發了一種基于親和型電化學生物傳感器,并將其用于肉類樣品中頭孢噻呋殘留的無標簽檢測,發現該方法對頭孢噻呋的檢出限低至0.01 μg/L。此外,B.B.Zhou等[72]采用電聚合法制備了分子印跡電化學傳感器,該方法可實現牛奶中呋喃西林高特異性、高靈敏度的快速檢測,檢出限可達0.18 nmol/L。

3.4 酶聯免疫吸附法

酶聯免疫吸附(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)法是指將抗體與酶復合物結合,使用顯色方式進行檢測的方法,廣泛應用于疾病診斷、食品安全檢測、環境監測等領域。C Y.Zhao等[73]制備了一種用于抗生素檢測的超靈敏便攜式比色酶聯免疫吸附測定傳感器,該傳感器對氯霉素的檢出限達0.005 ng/mL,是傳統的紙質ELISA的1/200。

電化學分析法和酶聯免疫吸附法憑借快速、簡單、對儀器要求低等特點被用于動物源食品中抗生素殘留的檢測,但二者存在易受干擾、易出現假陽性且準確度較低等問題。

3.5 化學傳感法

3.5.1 熒光傳感法熒光傳感法是利用物質的熒光性質來檢測、識別和分析目標物質的方法。而熒光光譜法作為諸多熒光傳感法中的一種,是根據物質的熒光波長及強度進行物質的鑒定和檢測,具有靈敏度高、選擇性強、樣品使用量少等特點[74]。在所有抗生素大類中,僅少部分抗生素自身具有熒光特性,故大多數抗生素在采用熒光光譜法檢測時都需要依賴熒光探針構建熒光傳感體系。常見的熒光探針有碳點(Carbon Quantum Dots, CQDs)、量子點(Quantum Dots,QDs)、多孔金屬有機骨架材料(Metal Organic Framework, MOFs)等。其中,CQDs、QDs具有獨特的化學性質和優異的光學性能,被廣泛用于生物傳感器、生物成像等方面。Y.C.Jia等[75]以火龍果皮和1,2-乙二胺為前驅體,采用水熱法合成了單一氮摻雜碳點(N-CQDs),并將其作為一種多功能納米傳感器用于3種TCs抗生素的檢測。該方法對四環素、土霉素、金霉素的檢出限分別為33.8 nmol/L、40.5 nmol/L和41.9 nmol/L,為選擇廣泛的天然生物質合成CQDs提供了新視角。

此外,一些新型納米材料已被成功應用于抗生素的檢測。例如,X.Y.Yue等[76]采用一步水熱法成功合成了發光梭形含Al(Ⅲ)金屬有機框架(Al-MOF)納米片,將其作為熒光探針,通過內濾效應檢測牛奶中NFs抗生素。此傳感器對呋喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮的檢出限分別為0.53 μmol/L、0.583 μmol/L和0.838 μmol/L,與傳統檢測方法和其他熒光檢測方法相比,該傳感器具有快速、靈敏度高、穩定性好、抗干擾性能好等優點。Y.Li等[77]制備了CQDs@HZIF-8配合物,基于F536/F440兩種熒光信號的反向變化,構建了用于牛奶中TCs抗生素檢測的比例熒光傳感器。此方法對四環素、土霉素和多西環素的檢出限分別為6.56 nmol/L、29.46 nmol/L和30.58 nmol/L。

3.5.2 比色傳感法比色傳感法是一類具有樣品通量高、檢測速度快、靈敏度高、成本低、使用方便等特點的傳感技術[78]。該技術的比色信號轉導主要有兩大類:一類是基于貴金屬納米粒子的聚集,誘導其等離子體吸收光譜發生變化[79]。例如,C.G.Xu等[80]開發了一種以金納米顆粒(Gold Nanoparticles, AuNPs)作為信號轉換元件,采用雜交鏈反應輔助信號放大的比色法測定卡那霉素的方法。在卡那霉素存在的情況下,適體發夾DNA探針與卡那霉素結合,新暴露的DNA片段引發一連串的雜交鏈式反應,形成大量的雙鏈DNA(dsDNA);當加入鹽時,由于dsDNA與AuNPs之間的排斥作用,AuNPs會形成藍色聚集體;在最佳條件下,卡那霉素濃度在1～40 μmmol/L范圍內,520 nm與630 nm處的吸光度比值下降,檢出限為0.68 μmol/L。該方法可選擇性地將卡那霉素與其他抗生素區分開來,適用于加標牛奶樣品中卡那霉素的檢測,回收率較高。另一類是基于各種酶或模擬酶的催化顯色反應[79]。例如,P.Lavaee等[81]開發了一種用于檢測FQs抗生素的比色測定法,若環丙沙星存在,AuNPs可以發揮其催化活性使溶液顏色從黃色變為無色。該方法對FQs抗生素具有較高的選擇性,檢出限低至1.2 nmol/L。

綜上可知,化學傳感法在動物源食品抗生素殘留檢測中具有色變反應明顯、過程簡便快速等優勢,應用潛力巨大。

4 結語

本文梳理了動物源食品中抗生素的主要類型、殘留現狀及危害,綜述了動物源食品中常見抗生素的殘留檢測方法,得出:抗生素的主要類型有FQs、BLAs、MA、TCs、NFs、SAs、酰胺醇類和AGs抗生素;抗生素不僅可以預防和治療家禽疾病,還可用作飼料添加劑促進家禽生長,但過度使用導致的抗生素殘留問題屢見不鮮;抗生素殘留通過食物鏈在人體中累積,會導致過敏反應、耐藥性等副作用;目前常用的抗生素檢測方法有色譜法、光譜法、電化學分析法、酶聯免疫吸附法和化學傳感法,其中色譜法需要復雜的預處理過程且分析時間較長,難以滿足日常生活中對動物源食品抗生素殘留的快速即時檢測需求;酶聯免疫吸附法、電化學分析法等快檢方法易受干擾、易出現假陽性且準確度較低。相比而言,化學傳感法在抗生素殘留檢測中具有過程簡便快速、色變反應明顯等優勢,應用潛力巨大。但目前采用化學傳感法進行抗生素檢測仍存在檢測種類少、難以實現多種類型抗生素同時檢測等問題。因此,在未來可針對抗生素的結構特性進行深入剖析,開發能與多種及多類型抗生素特征官能團發生特異性作用的傳感材料。同時,根據待測抗生素的結構特性對傳感材料進行特異性結構優化以增大檢測的特異性,為傳感法的進一步發展提供新思路和新方法。