陳皮心血管藥理作用的網絡解析

郭 杰

(鶴壁職業技術學院 醫學院，河南 鶴壁 458030)

心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)是心臟及外周動脈、靜脈、微血管等血液循環系統疾病的統稱.臨床上常見的CVD有高血壓、心肌病、心肌炎、冠心病、心臟瓣膜疾病等，具有發病率高、致殘率高、死亡率高等特點，已成為人類死亡的頭號病因[1].由于CVD發病機制復雜，單靶點藥物難以統籌兼顧，患者往往要服用抗凝、降壓、調脂等多種藥物.

中藥具有多靶點、多環節和整體調節等特點，在CVD的預防和治療中具有很大潛力.陳皮(CitriReticulataePericarpium)始載于《神農本草經》[2]，為蕓香科植物橘及其栽培變種的干燥成熟果皮，性溫，味辛、苦，歸脾經、肺經，具有理氣健脾、燥濕化痰等功效，主要用于治療消化系統脾胃氣滯、嘔吐、呃逆[3]，以及呼吸系統濕痰、寒痰所致的咳嗽[4].近年研究[5-7]發現陳皮的很多化學成分，特別是黃酮類，具有調血脂、抑制血小板聚集、抗凝、抗炎、抗氧化等多種心血管藥理效應，但具體機制仍不清晰.本研究運用網絡藥理學的方法，探究陳皮治療心血管疾病的藥效物質、作用靶點、生物過程及信號通路，以期系統闡釋陳皮治療CVD的科學內涵，為其臨床應用拓展提供證據.

1 資料與方法

1.1 陳皮活性成分及成分-靶點網絡構建

通過中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.Php)收集陳皮的主要化學成分，根據OB≥30% 和 DL≥0.18初篩候選化學成分，同時結合文獻報道補充活性成分.以陳皮活性成分為研究對象，在TCMSP數據庫中檢索活性成分已知靶點，利用Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)查找活性成分的3D分子結構式，將.SDF格式導入DTPS靶點預測系統(http://demo.dtps.iprexmed.com/#/index)找出活性成分潛在靶點；再運用UniProt數據庫(http://www.uniprot.org/)將靶點統一轉換為基因名稱.將上述兩個來源的基因合并，構建陳皮靶基因集合，最后利用Cytoscape 3.7.2軟件構建陳皮活性成分-靶點網絡.

1.2 陳皮治療CVD相關基因庫的構建

運用GeneCards、DisGeNET、OpenTargets數據庫獲取CVD相關基因；將獲取的CVD基因按照相關性分值依次取排名前100的基因，篩除重復后合并，構建CVD基因庫.利用Venny 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)對CVD相關靶點與陳皮活性成分靶點映射取交集，確定陳皮治療CVD的靶點.

1.3 靶蛋白相互作用研究

利用String平臺(https://string-db.org/)研究陳皮治療CVD靶蛋白間的相互作用(protein-protein interaction，PPI)，將蛋白種類設置“Homo Sapiens”進行操作，最低相互作用閥值設為“medium confidence =0.4”，其余參數保持默認，結果保存為.TSV格式并導入Cytoscape 3.7.2軟件，再利用“Network Analysis” 插件進行網絡拓撲屬性分析，設置節點大小反映度值(degree)變化，邊的粗細反映介度值(betweenness)大小，建立靶點蛋白相互作用網絡.

1.4 基因本體(Gene Ontology，GO)分析

運用 Cytoscape 3.7.2 軟件中“ClueGO”插件對核心靶點進行GO富集分析，探討關鍵靶點在體內可能實現的生物分子過程.設置：定義來源為“Homo sapiens”(智人)，P值≤0.05，Interval Min Level =2，Max Level =3；選擇生物過程(biological process)模塊對基因進行生物功能注釋.

1.5 KEGG通路研究

通路分析能顯示蛋白質相互關系網絡中不同信號通路的重要性程度，本研究利用DAVID平臺(Version 6.8)結合Omicshare數據庫篩選核心通路，將結果以氣泡圖形式呈現，并根據富集因子值分析核心通路富集程度，以探究陳皮治療CVD可能的作用機制.其中，節點大小表示富集的靶點數量.

2 結果

2.1 陳皮活性成分及活性成分-靶點網絡構建

按照OB≥30%和DL≥0.18篩選活性成分，雖然橙皮苷、柚皮苷、檸檬烯和辛弗林等陳皮成分的OB值或DL值較低，但它們含量較高且文獻[8-10]證實它們確有藥理活性，故最終納入11個活性成分，見表1.根據結構特點，11個活性成分可分為黃酮類(柚皮素、橙皮素、米橘素、川陳皮素、橙皮苷、桔皮素、柚皮苷)、揮發油類(檸檬烯、α-蒎烯)和生物堿類(辛弗林、N-甲基酪胺).

表1 陳皮活性成分及其信息

圖1系活性成分-靶點網絡，共有223個節點和275條邊.其中7個箭頭節點代表黃酮類成分，2個八邊形節點代表揮發油類成分，2個菱形節點代表生物堿類成分，212個圓形節點代表陳皮的作用靶點，275條邊代表陳皮活性成分對靶點的作用.

圖1 “活性成分-靶點”網絡

2.2 陳皮活性成分治療CVD靶點分析

從TCMSP平臺和DTPS靶點預測系統獲得212個活性成分作用靶點；綜合GeneCards、DisGeNET、OpenTargets數據庫篩得232個CVD靶點.如圖2所示，應用Venny 2.1將兩者映射取交集得到陳皮治療CVD靶點32個，依據靶點功效可分為炎癥反應類、血壓調節類、糖脂代謝類、凝血纖溶類以及離子通道類等，均與心血管系統主要病理機制密切相關，見表2.

圖2 成分-CVD靶點韋恩圖

表2 陳皮治療CVD靶點的歸類

2.3 PPI網絡分析

如圖3所示，32個CVD治療靶點均參與了PPI網絡，248條連線代表了靶點間的相互作用，其中度值較大的靶點包括蛋白激酶B(degree=27)、一氧化氮合酶(degree=24)、腫瘤壞死因子(degree=23)、載脂蛋白E(degree=22)、內皮素-1(degree=22)、胰島素樣生長因子1(degree=22)、細胞腫瘤抗原p53(degree=21)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(degree=21)、瘦素(degree=21)、基質金屬蛋白酶-9(degree=21)、白細胞介素-1β(degree=21)、前列腺素內過氧化物合酶2(degree=21)、脂聯素基因(degree=20)、細胞間黏附分子1(degree=20)等，說明上述靶點在網絡中處于主要位置，可能是陳皮活性成分治療CVD的關鍵靶點.

圖3 靶蛋白PPI網絡

2.4 GO富集注釋

32個靶點參與了113個GO條目，包含610條層級關系連線，可分為活性氧生物合成過程(34.74%)、脂質代謝過程正向調控(14.74%)、小分子代謝過程正向調控(8.95%)、脂質定位(8.95%)、血液凝固(6.84%)、平滑肌細胞增殖(5.26%)、平滑肌細胞增殖調控(3.68%)、肌肉適應(3.16%)、活性氮代謝過程(3.16%)、氧化還原酶活性調控(2.63%)、平滑肌適應性(2.63%)、平滑肌細胞增殖負調控(2.11%)、脂肪蓄積負調控(1.58%)、飲食過量的反應(0.53%)、血壓調節(0.53%)、寒冷反應(0.53%)等16大類，見圖4、圖5.

圖4 GO功能注釋網絡

圖5 GO功能注釋餅狀圖

2.5 KEGG信號通路分析

KEGG信號通路富集共篩出16條與CVD形成、發展密切相關的信號通路，結果見表3.其中富集因子(Richfactor，靶基因/該通路所有基因的數量)較大的包括腫瘤壞死因子信號通路、HIF-1信號通路、雌激素信號通路、NF-kappa B信號通路、AMPK信號通路、VEGF信號通路、心肌細胞腎上腺素能信號、cGMP-PKG信號通路、cAMP信號通路、胰島素抵抗、MAPK信號通路、脂肪細胞脂解的調控、mTOR 信號通路、催乳素信號通路、PPAR信號通路、補體和凝血級聯等，見圖6.

表3 KEGG信號通路

圖6 KEGG信號通路點狀圖

3 討論

CVD是全球發病率最高的非傳染性疾病之一，也是人類致死、致殘的主要原因.據估算，中國現有2.9億CVD患者，CVD的患病率和死亡率持續上升，占居民疾病死因首位，已成為嚴重的公共衛生問題[11].臨床治療CVD的藥物主要有他汀類降脂藥、阿司匹林等抗血小板聚集藥，以及多種降壓藥等[12]，但這些藥物在使用中存在一定的不良反應及耐藥現象[13].

陳皮具有調血脂[14]、抗血栓[15]、抗動脈粥樣硬化[16]、心肌保護[17]等多重心血管藥理作用，但具體藥效物質和作用機制尚未系統明確.本研究發現陳皮作用于ESR1和NOS3等調節血壓；作用于APOB和PPARG等調節脂代謝；作用于F2和PLG等平衡凝血纖溶系統；作用于SCN5A、KCNQ1等離子通道抗心律失常.研究[18-19]表明ESR1可促進NOS3的表達，進而增加血管內NO釋放來舒張血管；而NOS3的+G894T多態性位點則可能是高血壓繼發左室肥厚遺傳易感性的標志之一.冠狀動脈粥樣硬化患者血漿中APOB水平明顯升高[20]，PPARG缺乏的小鼠很容易發生嚴重的脂肪代謝異常[21].此外，SCN5A、KCNQ1基因突變均會導致嚴重的心律失常[22-23].這些靶點涉及的活性成分主要包括柚皮苷、柚皮素、橙皮素、橙皮苷等，實驗[24]證實橙皮苷可降低高血脂大鼠血清總膽固醇、低密度脂蛋白水平，升高高密度脂蛋白水平；抑制由膠原、花生四烯酸、ADP和凝血酶誘導的大鼠血小板凝聚，延長小鼠尾靜脈出血時間.橙皮素可減輕動脈粥樣硬化病變[25]；促進脂肪酸氧化和三羧酸循環，降低肝內脂肪酸的量.劉正兵等[26]還發現橙皮苷、橙皮素及其衍生物可抗心肌凋亡、抑制血管平滑肌增殖、遷移，在心肌損傷、心臟重構、心肌缺血、梗死等方面均有良好作用.柚皮苷主要通過抑制VCAM-1、MCP-1和ICAM-1表達，抑制巨噬細胞滲入、平滑肌細胞增殖、免疫細胞黏附、內皮功能紊亂，減少高脂動物血管斑塊的發展，從而發揮抗動脈粥樣硬化的作用[27].與此同時，柚皮素、柚皮苷可使小鼠主動脈粥樣斑塊中SRA、LOX-1和ACAT1表達下調，進而抑制小鼠主動脈粥樣硬化斑塊的形成[28].

GO富集分析發現這些靶點主要富集在血脂調節方面的脂質代謝過程正調控、脂質定位、脂肪蓄積負調控，血管平滑肌方面的平滑肌細胞增殖、平滑肌細胞增殖調控、平滑肌細胞增殖負調控，氧化損傷方面的活性氧生物合成過程、氧化還原酶活性調控，以及血液凝固、血壓調節等.這些生物過程大都與CVD密切相關，如血管平滑肌細胞增殖和遷移對動脈粥樣硬化的發生具有重要作用[29]；活性氧(ROS)是體內細胞重要的第二信使，研究[30]證實其在體內的生物合成和抗氧化防御體系的不平衡會導致人體代謝性疾病和心血管疾病中的血管損傷.KEGG富集包括脂肪代謝相關的PPAR信號通路和脂肪細胞脂解調控；血凝調控的補體和凝血級聯；心血管調控的VEGF、心肌細胞腎上腺素能信號通路；炎癥調控的TNF和NF-kB信號通路；以及雌激素、胰島素抵抗等內分泌通路.這些KEGG通路與GO生物過程相互印證，顯示陳皮活性成分通過調血脂、抗炎、抗血栓、心肌保護等多個效應治療CVD.如NF-κB信號通路的異常激活與動脈粥樣硬化的發生發展密切相關[31]，抑制NF-κB信號通路可減少ICAM-1、VCAM-1等基因的表達進而發揮延緩動脈粥樣硬化病變的作用[32].目前已證實，VEGF對維持正常血壓具有重要的作用，其可促使血管內皮細胞釋放一氧化氮和前列腺素等繼而使血管舒張、血壓降低[33].另外，經研究[34]發現β腎上腺素受體與心衰的發生密切相關，其機制可能是通過腎上腺素能信號通路改變、交感神經興奮等過程實現.

綜上所述，本研究基于網絡藥理學構建陳皮活性成分-靶點網絡、靶蛋白互作網絡，富集靶點GO生物過程及KEGG通路，進而預測到陳皮抗炎、抗氧化、抗凝、保護心肌，以及調節血脂等心血管藥理作用，為陳皮治療CVD的實驗研究提供了方向與線索.