不同環境條件對隆德假單胞菌生物被膜形成能力的影響

劉永吉，劉根梅 ，劉國凌，康林芝

（1.韶關學院英東食品科學與工程學院，廣東韶關 512005；2.廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室，廣東韶關 512005）

生物被膜（Biofilm，BF）是細菌抵抗不良生存條件、適應環境的一種生存模式，多數細菌以生物被膜狀態群居生長[1]。生物被膜是由胞外多糖類、蛋白類、eDNA、脂類等胞外基質（Matrix）包裹著細菌形成的結構化、組織化的三維復合結構[2]。這些生物被膜基質將細菌群體包裹起來并緊密黏附在接觸面上，增加了內部細菌對抗生素、營養不足、酸堿和溫度改變等不良生存條件的耐受性和適應性[3]。因此，細菌一旦在食品或食品設備表面形成生物被膜就具有更強的適應性和抵抗力，會導致常規的抑菌手段、清洗和消毒等衛生措施達不到應有效果，往往難以清除并成為持續的污染源，會反復污染食品并引發食品腐敗和食源性疾病[4-5]。食源性細菌的生物被膜已成為影響食品安全和衛生的新的危害因子。在食品工業中控制被膜態的細菌對預防和阻止食品腐敗非常重要[6]。

隆德假單胞菌（Pseudomonas lundensis，PL）是腐敗冷藏肉中經常分離到的優勢腐敗菌[7-8]，也是生牛奶中的主要腐敗菌[9-10]，還是少量水產品中的腐敗菌[11-12]。采用經典的結晶紫染色定量法和激光共聚焦顯微鏡結構觀察對PL的研究表明：PL具有較強的生物被膜產生能力，較短生物被膜形成周期，能在12～24 h內形成大量的胞外復合物，而且其生物被膜的產量與蛋白酶的活性具有正相關性[13]。在腐敗肉中，采用原位熒光染色和激光共聚焦觀察發現：PL在冷藏豬肉腐敗過程能夠形成易于分散的生物被膜，與莓實假單胞菌（Pseudomonas fragi）相比，PL在肉表面的生物被膜更具有立體性[14]。同時該菌在10 ℃的低溫條件下比在25 ℃時在牛肉中形成更多的生物被膜[15]。鑒于該菌在導致肉類腐敗中的危害，有研究者針對性地探索了肉桂醛、3-蒈烯對該菌的抑菌作用，以促進冷藏肉類保鮮[16-17]。在自然和食品加工環境中，細菌生物被膜的形成或消除受到多種環境條件的影響。目前，國內外對隆德假單胞菌生物被膜的研究已確定了其在冷藏條件的生物被膜特征，但缺少更多食品相關環境條件下其生物被膜形成能力的研究。本文主要研究不同環境條件對隆德假單胞菌生物被膜形成能力的影響，為更好地認識與防控隆德假單胞菌生物被膜的潛在危害提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

隆德假單胞菌106 分離自冷藏的豬肉，甘油管-80 ℃保存于本實驗室[13]；胰蛋白胨大豆肉湯（Tryptone Soy Broth, TSB） 青島海博生物科技有限公司；營養肉湯（Nutrient Broth, NB）、LB培養基 杭州百思生物技術有限公司；氯化鈉、乙酸 天津市大眾試劑研發中心；氯化鎂、甲醇 天津市百世化工有限公司；葡萄糖 廣州化學試劑廠；結晶紫 天津市大茂化學試劑廠。

BXM-30R立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；SHA-B數顯水浴恒溫振蕩器 常州普天儀器制造有限公司；SW-CJ-1D單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；SM600酶標儀 上海水創醫療器械有限公司，Zeiss LSM 710激光共聚焦顯微鏡（Confocal Laser scanning microscopy，CLSM） 德國Carl Zeiss公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化與菌懸液制備 將甘油保藏的德隆假單胞菌平板劃線，在30 ℃培養24 h，連續活化二次。再挑取第二次平板畫線活化后的單菌落于裝有5 mL TSB培養基的試管中，在30 ℃下180 r/min搖床過夜培養兩次，取第二次液體活化的菌種，用無菌TSB培養基稀釋至OD600nm為0.5待用。

1.2.2 生物被膜的形成與測定 將制備好的菌液5 μL接種在含195 μL TSB培養基的96孔酶標板中，每個測試至少接種5個平行孔，以無菌的TSB培養基為空白對照。將接種好的酶標板，放入恒溫生化培養箱中，30 ℃靜置培養12 h后取出，小心除去未黏附的浮游菌培養液。再用無菌生理鹽水清洗3次，隨后用200 μL甲醇固定15 min，移去甲醇并晾干，再用1%的結晶紫200 μL/孔染色5 min后用流水沖洗至沒有顏色流出，自然晾干后用200 μL/孔的33%乙酸溶解5 min，最后用酶標儀測定630 nm處的吸光度，以OD630值表示隆德假單胞菌生物被膜形成量或生物被膜形成能力[18-19]。

1.2.3 不同培養基和營養脅迫對隆德假單胞菌生物被膜形成的影響 取制備好的菌液5 μL分別接種在含195 μL的TSB培養基、NB培養基和LB培養基的96孔酶標板中，30 ℃靜置培養生物被膜12 h，處理后測定OD630值，比較不同培養基對隆德假單胞菌生物被膜形成的影響。

為探究培養基濃度對隆德假單胞菌的影響，以TSB培養基為基礎，用蒸餾水將培養基分別稀釋10倍、20倍、50倍和100倍，以不稀釋的培養基為對照組樣品，然后分別將隆德假單胞菌按1.2.2方法接種在5種不同濃度的培養基中進行生物被膜培養和測定，評價細菌在營養脅迫下的生物被膜形成能力。

1.2.4 不同接種量對生物被膜形成的影響 將二次過夜活化后的菌液稀釋分成6個不同的菌密度，使OD600分別為1.00、0.50、0.20、0.10、0.05和0.01。當接種菌液的OD600為1.00時，采用平板計數法測定隆德假單胞菌的菌落數約為5.0×108CFU/mL。分別取5 μL菌液接種在含195 μL TSB培養基的96孔板中，接種后不同梯度的孔板中菌落數分別為：1.3×107、6.3×106、2.5×106、1.3×106、6.3×105、2.5×104CFU/mL。按1.2.2方法培養并測定不同接種量對生物被膜形成的影響。

1.2.5 不同理化因素對隆德假單胞菌生物被膜形成的影響

1.2.5.1 葡萄糖濃度對生物被膜形成的影響 所購TSB培養基含有葡萄糖，按使用說明配制成1 L液體TSB培養，其中含有0.25%的葡萄糖，在此基礎上分別額外添一定濃度的葡萄糖，使培養基中的葡萄糖最終濃度分別為0.25%、0.50%、0.75%、1.25%、2.25%、4.25%、6.25%和8.25%，按1.2.2方法培養并測定不同葡萄糖濃度對隆德假單胞菌生物被膜形成的影響。

1.2.5.2 pH對生物被膜形成的影響 分別用稀鹽酸和稀氫氧化鈉溶液配制pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的TSB培養基，按1.2.2方法比較不同pH對隆德假單胞菌生物被膜形成的影響。

1.2.5.3 NaCl添加量對生物被膜形成的影響 分別配制最終質量分數為0.50%、1.00%、1.50%、2.00%、3.00%、4.00%、5.00%、6.00%、7.00%、8.00% NaCl的TSB培養基，按1.2.2方法培養測定不同NaCl濃度下PL生物被膜的形成情況。

1.2.5.4 Mg2+濃度對生物被膜形成的影響 分別配制含0.00%、0.25%、0.50、1.00%、1.50% MgCl2的TSB培養基，培養并測定生物被膜，按1.2.2方法比較不同濃度的Mg2+對PL生物被膜形成的影響。

1.2.6 在不銹鋼表面的生物被膜形成能力 將制備好的PL菌液按照1%的比例接種于含無菌不銹鋼片（12 mm×12 mm×1 mm，304）和1 mL TSB培養基的24孔板中。將24孔板至于30 ℃條件下分別培養12 h，在30 ℃條件下分別培養12 h后取出。取出后將菌液輕輕吸出，用0.05 mol/L的PBS清洗3次，每次3～5 min。然后用2.5%戊二醛固定2 h并再次用PBS清洗；吸干水份后用50 μg/mL的FITC-conA熒光染色[20]，置于4 ℃避光染色30 min后用PBS沖洗出去染料，用激光共聚焦顯微鏡采集圖像，并用儀器自帶軟件處理圖片，觀測生物被膜特征。

1.3 數據處理

所有試驗至少重復兩次，實驗數據用SPSS 19.0進行分析，顯著性水平設定為P＜0.05，數據用Excel軟件處理并繪圖，CLSM成像圖由設備自帶軟件生成。

2 結果與分析

2.1 培養基和營養對生物被膜形成的影響

細菌生物被膜能夠抵抗營養不良的生長環境，而營養物質的可利用情況也對細菌生物被膜的形成有直接影響。營養成分的限制可能會導致細菌在傳代的過程中發生更多的適應性變異，如浮游型銅綠假單胞菌（Pse. aeruginosa）在只含有葡糖糖、乳酸和氨基酸的培養基中，出現了典型的生物被膜調控基因表達增加和由于群體感應基因激活而誘導的毒力基因表達增加等現象[21]。隆德假單胞菌在LB培養基和NB培養基中生物被膜形成量無顯著差異（P＞0.05），但其在TSB培養基中的生物被膜形成量顯著高于其在LB培養基和NB培養基中的生物被膜形成量（P＜0.05），如圖1所示。對比三種培養基的具體成分發現，TSB培養基中含有葡萄糖，而LB培養基和NB培養基中無葡萄糖添加。這表明含葡萄糖的TSB培養基更適合隆德假單胞菌產生生物被膜。后續實驗的培養基均采用了TSB培養基。

圖1 不同培養基對隆德假單胞菌生物被膜形成的影響Fig.1 Effects of different culture medium on the biofilm formation of Pse. lundensis

以TSB初始濃度為對照，將TSB稀釋不同的倍數測定不同營養脅迫對隆德假單胞菌生物被膜形成能力的影響，結果如圖2所示。隨著培養基的稀釋倍數增大和營養物質濃度降低，各梯度之間有顯著差異，隆德假單胞菌的生物被膜形成量呈現下降趨勢。當培養基稀釋100倍時，隆德假單胞菌的培養基呈透明狀，生物被膜形成量極低，生物被膜量值為0.05±0.03，遠低于營養充足的初始濃度組的生物被膜量1.75±0.35，也低于培養基稀釋50倍造成的營養脅迫下形成的生物被膜量0.24±0.17。對于成熟的生物被膜，營養缺乏會促進生物被膜的擴散而減少。對于惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）的生物膜，營養缺乏會導致細胞中磷酸二酯酶 BifA 水解 c-di-GMP，進而導致粘附素 LapA 蛋白水解，隨后釋放生物膜細胞，最終導致生物被膜擴散而減少生物被膜[22]。而在細菌生物被膜形成初期，營養限制可能會直接限制細菌生物被膜的形成。在多菌生物被膜系統中，往往會出現營養競爭性限制。當銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的混合生物被膜發展到成熟階段后出現了營養競爭壓力，導致了群體感應信號的釋放和調控二者細胞表型變化以適應營養不足[23]。

圖2 營養脅迫對隆德假單胞菌生物被膜形成的影響Fig.2 Effect of nutrition stress on the biofilm formation of Pse. lundensis

2.2 菌液起始生物量對隆德假單胞菌生物被膜形成的影響

為探究菌液中隆德假單胞菌的生物量對生物被膜形成的影響，將接種了不同起始生物量的微孔板進行了生物被膜孵化培養，結果如圖3所示。在營養充足的情況下，隆德假單胞菌初始接種生物量相差1000倍的情況下，接種菌液OD600從0.01到1.00的變化過程中，即微孔板中該菌菌落數在2.5×104至1.3×107CFU/mL范圍時，各組生物被膜的形成量沒有顯著差異（P＞0.05）。這表明在一定范圍內，隆德假單胞菌生物被膜的形成能力并沒有因初始生物量降低而減弱。這種現象可能是與該菌的生物被膜形成能力較強有關。對該菌的生物被膜形成周期的研究表明，在30 ℃時該菌的生物被膜成熟期較短，在6～8 h內就能夠形成較多的生物被膜[13]；而6～8 h的培養時間屬于細菌的對數增長初期，此時的菌密度相對穩定期仍然較低。在該菌數量較低的初始階段就應注意防控其生物被膜的形成。

圖3 不同菌液濃度對隆德假單胞菌生物被膜形成的影響Fig.3 Effect of bacteria concentration on the biofilm formation of Pse. lundensis

2.3 pH對隆德假單胞菌生物被膜形成的影響

生物被膜作為其內部微生物的保護性外殼，被生物被膜包裹在內部的被膜菌比浮游菌能夠更好地抵抗極端pH壓力[24]。生物被膜菌適應極端酸性環境的原因可能與極端酸性pH條件下酸和重金屬的結合導致生物被膜胞外復合物組成發生顯著改變有關[25]本研究以浮游菌為起點測定了不同pH對其生物被膜形成的影響，發現培養基pH的變化對隆德假單胞菌生物被膜形成有較大影響，如圖4所示。隆德假單胞菌的生物被膜形成量隨培養基的pH升高呈現先出現倒V形變化趨勢，在pH低于4.0或大于10.0時基本不生長，無生物被膜形成。在pH為8.0時，隆德假單胞菌的生物被膜產生量均達到最高值。這表明隆德假單胞菌在偏弱堿性的條件下能夠較好地形成生物被膜，而在過酸或過堿的環境中其生長和生物被膜的形成受到抑制。細菌形成生物被膜有利于抵抗偏酸的環境，但是當pH偏離細菌正常代謝的適宜條件時，細菌的生長代謝整體受到了抑制[26]。因此pH對細菌生物被膜形成的影響或者生物被膜菌對pH的適應范圍，與細菌對酸堿環境的實用功能能力密切相關。變形鏈球菌（Streptococcus mutans）、茸毛鏈球菌（Streptococcus sobrinus）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）的生物膜量在pH為7.0～7.5時最大，而在pH為5.0或5.5時因菌落數低于在較高pH的菌落數而生物被膜量較小[27]。而對于創傷弧菌（Vibrio vulnificus）分別在pH為5.5、7.5和8.5培養時，野生型菌株和分離得到的致病菌株都在pH5.5時觀察到更高的生物膜產量[28]。

圖4 不同pH對隆德假單胞菌生物被膜形成的影響Fig.4 Effect of pH on the biofilm formation of Pse. lundensis

2.4 葡萄糖濃度對生物被膜形成的影響

環境或食品基質中糖含量對其中的微生物的生長代謝有較大影響。對于隆德假單胞菌，當TSB培養基中的葡萄糖濃度為0.25%、0.50%和0.75%時，其生物被膜的形成量無顯著差異（P＞0.05），但當葡萄糖濃度達到1.25%以上時，隆德假單胞菌的生物被膜產生量顯著降低（P＜0.05）（如圖5所示）。本研究發現當培養基中的葡萄糖質量分數達到2.25%、4.25%、6.25%和8.25%時，隆德假單胞菌生物被膜的形成量無顯著差異（P＞0.05）。這表明低濃度的葡萄糖環境對隆德假單胞菌生物被膜的形成沒有影響，而高于1.25%的葡萄糖濃度形成了較高的滲透壓，抑制了細菌生長，進而抑制了隆德假單胞菌生物被膜的形成。

圖5 不同葡萄糖濃度對隆德假單胞菌生物被膜形成的影響Fig.5 Effect of glucose concentration on the biofilm formation of Pse. lundensis

2.5 NaCl 添加量對生物被膜形成的影響

NaCl添加量對隆德假單胞菌生物被膜的生長有明顯的影響，如圖6所示。隨著TSB培養基中NaCl添加量的增加，隆德假單胞菌生物被膜的形成量呈現先增加后降低的趨勢。在NaCl的添加量在1%～3%時，該菌的生物被膜形成量之間無顯著差異（P＞0.05），與沒有在培養基中額外添加NaCl的培養條件相比（圖3，OD600=0.5）也無顯著差異（P＞0.05）。在添加的NaCl質量分數大于3%后，其生物被膜形成量隨NaCl質量分數的升高而降低；添加的NaCl的質量分數在6%及以上時，隆德假單胞菌幾乎沒有形成生物被膜，其生物被膜形成量與無菌空白對照無差異。這可能是因為在4%和5%的NaCl質量分數下隆德假單胞菌的生長受到了一定的抑制；而NaCl質量分數超過6%時，該菌的生長完全受到了高滲透壓的抑制。但也有研究指出，部分隆德假單胞菌具有較高的耐鹽性，在9% NaCl濃度下仍然能夠生長[11]。

圖6 NaCl添加量對隆德假單胞菌的生物被膜形成的影響Fig.6 Effect of the addition of NaCl on the biofilm formation of Pse. lundensis

2.6 Mg2+ 對生物被膜形成的影響

低濃度的Mg2+對部分細菌的生物被膜形成有促進作用[29]，Mg2+對細菌生物被膜的結構也有影響。對于隆德假單胞菌，不添加Mg2+與Mg2+添加量為0.25%試驗組對比，其生物被膜形成量無顯著差異（P＞0.05），如圖7所示。這表明在此濃度區間內，Mg2+的添加量對隆德假單胞菌生物被膜的生長無顯著影響。當Mg2+的添加量超過0.50%后，生物被膜量顯著降低（P＜0.05），且Mg2+濃度為0.50%時，隆德假單胞菌生物被膜形成量最少，與其他各組均有顯著差異（P＜0.05）。這表明，在測試范圍內，低濃度的Mg2+對隆德假單胞菌生物被膜的形成有促進，高濃度的Mg2+對隆德假單胞菌生物被膜的形成有一定抑制作用；高于本研究中的Mg2+對該菌生物被膜形成的影響趨勢仍需要進一步研究。對于部分細菌，高濃度的Mg2+脅迫可能通過抑制pilV和pilW基因表達，減少IV型菌毛形成，進而減弱細菌的附著能力和運動能力，使細菌生物膜變得更薄、更松散，最終減少了生物膜的形成[30]。對于流動的物料體系，在流體動力學模擬下，低濃度的Mg2+有利于銅綠假單胞菌（Pse. aeruginosa）形成生物被膜，增加其在流動工程系統下游的定植；而高Mg2+濃度可能會使銅綠假單胞菌的生物膜轉向粘塑性機械狀態，這導致對臨界剪切應力的特征響應，生物膜變脆例而容易撕裂或脫落[31]。

圖7 不同Mg2+濃度下隆德假單胞菌的生物被膜產生量Fig.7 Effect of the concentration of Mg2+ on the biofilm formation of Pse. lundensis

2.7 隆德假單胞菌在不銹鋼表面的黏附

部分細菌在不銹鋼食品加工設備表面能夠形成生物被膜，被膜菌則會對食品造成持續的污染。實驗觀察了隆德假單胞菌在不銹鋼表面的黏附情況。通過激光共聚焦顯微鏡的觀察研究發現，該菌在304不銹鋼表面能夠形成較致密的生物被膜（如圖8A），其在不銹鋼表面形成的生物被膜能夠較致密地黏附在不銹鋼接觸面，其生物被膜厚度達到50 μm以上，且具有一定的蘑菇樣立體結構（圖8B和圖8C），符合典型的細菌生物被膜結構特征。有研究指出熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）在不銹鋼表面能夠快速黏附并形成生物被膜[32]。該菌在不銹鋼表面形成生物被膜的能力與熒光假單胞菌類似。這表明隆德假單胞菌具有在食品加工的金屬設備表面形成生物被膜并造成污染的潛力。

圖8 隆德假單胞菌在304不銹鋼表面形成生物被膜的激光共聚焦顯微結構圖Fig.8 CLSM images of biofilm structures and the development of polysaccharides of Pse. lundensis

3 結論

本文研究了不同環境條件對隆德假單胞菌生物被膜形成能力的影響。隆德假單胞菌能夠在較低的接種密度下形成生物被膜，其生物被膜形成能力受營養條件、葡萄糖濃度、pH、NaCl濃度、Mg2+等環境因子的影響。該菌在pH為8.0的弱堿性的條件下形成生物被膜量最多。1.25%以上的葡萄糖濃度、4%以上的NaCl濃度和0.5%的Mg2+濃度能夠顯著抑制隆德假單胞菌生物被膜的形成（P＜0.05），同時，該菌在一定濃度下具有在不銹鋼表面形成典型生物被膜的能力。本研究結果為調節食品加工環境，防控隆德假單胞菌生物被膜形成提供了理論支持。