抗體原液凍融過程中穩定性探究及凍融工藝建立

劉向東，錢軍華，王威

自 1986年全球首個單抗藥物批準上市以來，經過30 多年的發展，單抗目前已成為全球生物制藥增長最快的細分領域。近年來我國的抗體藥物也有了迅速的發展，截至2021年 11月，已批準上市的國產單抗藥物數量達 31 個[1]。生產中單抗藥物主要通過基因工程技術構建表達質粒并轉染中國倉鼠卵巢細胞（CHO 細胞），經 CHO 細胞生長培養表達所需蛋白并純化獲得抗體原液，最后制劑灌裝得到單抗成品。為了更好地保護蛋白的穩定，保證原液的質量，延長有效期，抗體原液一般都選擇低溫冷凍保存，灌裝時重新解凍后使用。有研究顯示抗體原液在凍融過程中，在-5 ～ 0 ℃ 時發生相變（固液兩態轉化），形成冰晶體，內部溶質產生冷凍濃縮，酸堿度失衡，局部 pH 值及離子強度發生變化，蛋白發生聚集[2-4]?？贵w的聚集大多都是不可逆的，有學者提出了抗體聚集物有可能通過兩種途徑使正在接受抗體類藥物治療的患者產生免疫原性：T 細胞依賴途徑以及細胞因子激活途徑，而且分子量越大的聚集物其免疫原性越強，最終，免疫原性反應不僅大幅降低了藥物體內的療效，而且易引發 I 型超敏反應[2]。因此有必要針對抗體原液凍融過程穩定性及影響因素進行研究，以及建立穩定的原液凍融工藝，指導生產。

以公司在研的單抗產品為例，參照《中華人民共和國藥典》2020年版（ChP 2020）四部中“生物制品穩定性試驗指導原則”，通過縮小模型實驗探究固有因素和可變因素在凍融過程中對原液蛋白穩定性的影響。固有因素包括分子類型和蛋白濃度；可變因素包括原液的包裝形式、包裝規格和凍融條件。因對目標函數（蛋白質量）沒有充分的實驗數據分析和預判，所以選擇單因素“優選法”（即斐波那契法）進行實驗設計，每個實驗因素包含不同的水平。實驗結束后通過不同的策略組合，運用統計學原理分別以橫向與對照品（未經凍融的樣品）進行比較，縱向與不同分子類型、蛋白濃度、包裝形式、包裝規格以及凍融條件進行比較，以探討抗體原液凍融過程穩定性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗樣品 選用 5 種抗體原液，分別為原液 1（蛋白濃度：50 mg/ml，IgG1 野生型）、原液 2（蛋白濃度：10 mg/ml，IgG1 突變型）、原液 3（蛋白濃度：50 mg/ml，IgG1 突變型）、原液 4（蛋白濃度：150 mg/ml，IgG1 突變型）、原液 5（蛋白濃度：50 mg/ml，IgG4 突變型），均為本公司產品。

1.1.2 儀器和設備 -60 ℃ U410-86 型超低溫冰箱為德國Premium 公司產品；34970A 型多路溫度記錄儀購自安捷倫公司；所用材料：凍存瓶（規格：125 ml、500 ml 和1000 ml，材質：聚碳酸酯）購自美國 Nalgene 公司；凍融袋（規格：125 ml、500 ml 和 1000 ml，材質：多層復合膜）購自美國Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 穩定性研究方法

1.2.1.1 樣品冷凍 按照表1 實驗設計，每個容器分裝80% 標識體積的原液，插入溫度記錄探頭，使其垂直懸空在溶液中心位置，將所有樣品一起放入 -60 ℃ 冰箱，開啟多路溫度記錄儀記錄溫度曲線。待所有樣品溫度都降至-60 ℃ 以下，保持 4 h 以上，使產品徹底凍結。

表1 實驗設計

1.2.1.2 樣品解凍 解凍時分別置于不同實驗條件下靜止解凍，至所有冰晶體全部融解，解凍結束。

1.2.1.3 反復凍融 選取樣品 1（IgG1 野生型）、樣品 4（IgG1 突變型）和樣品 7（IgG4 突變型）3 種不同分子類型樣品按照實驗 1、4 和 7 條件反復凍融 3 次，考察反復凍融對蛋白穩定性影響。

1.2.1.4 樣品檢測 樣品解凍后取樣按照 ChP 2020三/四部中相關測定方法進行 pH、蛋白含量、不溶性微粒、分子排阻-高效液相色譜（size exclusion chromatography-high perfermance liquid chromatography，SEC-HPLC）、離子交換-高效液相色譜（cation exchanged-high perfermance liquid chromatography，CEX-HPLC）、毛細管電泳/非還原法（non-reduced capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate，NrCE-SDS）、毛細管電泳/還原法（reduced capillary electrophoresis-sodium dodecyl sulfate，rCE-SDS）、結合活性和細胞生物學活性（或競爭活性）檢測。

1.2.2 凍融工藝建立方法

采用“4 + 2”的模式建立抗體原液凍融工藝，如圖1所示?！?”是指 4 步操作：①設計不同凍融條件，通過縮小模型進行實驗；②確定蛋白質量穩定的最長相變時間；③選擇放大后包裝材料及凍融條件；④結合凍融條件確定凍融參數，建立凍融工藝?！?”是 2 個原則：①是保持相變時間不變的原則進行工藝放大；②盡量避免反復凍融。

圖1 抗體原液凍融工藝建立

2 結果

2.1 穩定性研究結果

2.1.1 相變時間

相變時間是抗體原液凍融過程中，固-液兩種形態轉化時所持續的時間，一般在 -5 ～ 0 ℃ 之間，在凍融曲線中近似為一條直線。根據溫度記錄曲線，不同實驗條件下原液在凍融過程中相變時間如表2。

表2 相變時間（min）

2.1.2 樣品檢測 每個實驗編號對應樣品號（例，實驗編號 1 對應樣品 1），樣品檢測結果如表3。

表3 樣品檢測結果

2.1.3 固有因素和可變因素對凍融穩定性的影響

2.1.3.1 固有因素凍融穩定性結果（圖2） 結果顯示：①與對照品相比，IgG1 野生型、IgG1 突變型和 IgG4 突變型三種不同分子類型的原液凍融后樣品 pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 純度、rCE-SDS 純度、結合活性及生物學活性（或競爭活性）均未發生明顯變化，三種分子類型的原液不溶性微粒均稍有增加；IgG1 野生型和IgG1 突變型 SEC-HPLC 聚體含量未有明顯變化，而 IgG4突變型 SEC-HPLC 聚體含量增加 85.7%；②與對照品相比，IgG1 突變型抗體不同蛋白濃度（10 mg/ml、50 mg/ml和 150 mg/ml）原液凍融后樣品 pH、蛋白含量、SEC-HPLC聚體含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 純度、rCE-SDS純度、結合活性及生物學活性與對照品相比均未發生明顯變化，3 種蛋白濃度的原液凍融后不溶性微粒均稍有增加。

2.1.3.2 可變因素凍融穩定性結果 固有因素中通過對不同分子類型和不同蛋白濃度的原液凍融穩定性分析，IgG4突變型分子凍融過程中存在不穩定現象。因此在可變因素中選擇以 IgG4 突變型原液就不同包裝形式、包裝規格和凍融條件進行穩定性研究。結果（圖2）顯示：①與對照品相比，IgG4 突變型抗體原液在凍存瓶和凍融袋兩種包裝形式中凍融后樣品 pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS純度、rCE-SDS 純度、結合活性及競爭活性均未發生明顯變化，不溶性微粒均稍有增加；SEC-HPLC 聚體含量增加明顯，且同等規格下凍存瓶聚體含量增加更為明顯，125 ml和 500 ml 規格結論一致，凍存瓶中聚體含量分別較凍融袋增加 62.5% 和 33.3%，較對照品增加 85.7% 和 185.7%；②與對照品相比，IgG4 突變型抗體原液在凍存瓶中由 125 ml放大至 500 ml，凍融袋中由 125 ml 放大至 500 ml 和1000 ml，凍融后樣品 pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 純度、rCE-SDS 純度、結合活性及競爭活性均未發生明顯變化，不溶性微粒稍有增加；SEC-HPLC 聚體含量增加明顯，且隨著包裝規格的增大，聚體含量增加越多，凍存瓶規格增大 4 倍時，聚體含量增加 53.8%，凍融袋規格增大 4 倍時，聚體含量增加 87.5%，凍融袋規格增大8 倍時，聚體含量增加 175%；③與對照品相比，IgG4 突變型抗體原液在冷凍條件（-60 ℃ 冰箱和 -60 ℃ 冰箱 +泡沫箱）和解凍條件（25 ℃ 室溫、25 ℃ 水浴、8 ℃ 環境和冰水?。﹥鋈诤髽悠?pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 純度、rCE-SDS 純度、結合活性及競爭活性均未發生明顯變化，不溶性微粒均稍有增加；不同冷凍條件對 SEC-HPLC 聚體含量增加影響較小，不同解凍條件對聚體含量增加影響明顯，8 ℃ 環境解凍時聚體含量增加400%。

圖2 不同實驗條件下 SEC-HPLC 聚體檢測結果（樣品 5 ～ 13 橫向對照均為對照 5）

2.1.4 反復凍融對穩定性的影響 結果（圖3）顯示：①與對照品相比，IgG1 野生型、IgG1 突變型和 IgG4 突變型三種不同分子類型的原液反復凍融三次后樣品 pH、蛋白含量、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS 純度、rCE-SDS純度、結合活性及生物學活性（或競爭活性）均未發生明顯變化，不溶性微粒均稍有增加，且與凍融次數成正比例增加；② IgG1 野生型和 IgG1 突變型 3 次反復凍融后，SEC-HPLC 聚體含量未有明顯變化，IgG4 突變型反復凍融后，聚體含量增加明顯，且與凍融次數成正比例增加。

圖3 反復凍融后不溶性微粒和 SEC-HPLC 聚體檢測結果

2.2 凍融工藝建立

以本公司在研的某 IgG1 突變型抗體原液為例簡單介紹凍融工藝建立的過程，為讀者提供參考。通過縮小模型選用 125 ml 凍存瓶進行實驗，凍融曲線如圖4 所示。

圖4 IgG1 突變型抗體原液凍融曲線（溫度探頭 CH.101 ～ CH.104 分別檢測樣品 C、樣品 B、樣品 D 和樣品 A 的溫度，CH.105 ～ CH.109 檢測環境溫度）

由凍融曲線可知，樣品 A ～ 樣品 D 的相變時間分別為 70 min、145 min、220 min 和 480 min。

樣品解凍后取樣按照 1.2.1.4 檢測方法進行蛋白含量、不溶性微粒、SEC-HPLC 聚體、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS、rCE-SDS、結合活性和生物學活性檢測來分析不同相變時間對蛋白穩定性影響，解凍后樣品檢測結果如表4。

表4 縮小模型原液凍融檢測結果

與對照品相比，該抗體原液經最長相變時間 480 min凍融后，其蛋白含量、SEC-HPLC 聚體、CEX-HPLC 酸性峰、NrCE-SDS、rCE-SDS、結合活性和生物學活性均未發生明顯變化，不溶性微粒有增加，但在質量標準范圍（10 μm：≤ 6000 個，25 μm：≤ 600 個）限度以內。說明該抗體原液在最長相變時間 480 min 內進行凍融時，質量較穩定。

根據原液產量及每批次灌裝需求，放大后選用 1000 ml凍存瓶（分裝體積 ≤ 80%）分裝凍融，采用 -60 ℃ 冰箱冷凍和水浴解凍的方式，該條件下凍融時間約為 420 min，凍融時間小于 480 min，而相變時間更小，因此認為在該條件下凍融原液質量穩定。最后結合凍融條件確定凍融工藝參數為：1 L 凍存瓶（分裝體積 ≤ 80%），冷凍條件為 -60 ℃冰箱，解凍條件為 20 ～ 30 ℃ 水浴。

放大后按照上述凍融參數進行原液解凍后檢測，檢測結果如表5。

表5 放大后原液凍融檢測結果

根據上述檢測結果，均符合原液質量標準要求，且與對照品相比，各質量屬性均未發生明顯變化，說明該凍融工藝參數設定合理，凍融過程能夠保證原液穩定性。

IgG4 突變型抗體原液，選用 1000 ml 凍存瓶進行凍融工藝驗證，設定冷凍條件為 -60 ℃ 冰箱，解凍條件分別設為（25 ± 2）℃ 水浴和（25 ± 2）℃ 室溫，凍融時間分別約為 420 min 和 600 min，相變時間約為 160 min 和380 min。樣品解凍后經檢測，SEC-HPLC 聚體含量分別為0.7% 和 1.1%，前者較對照品相比聚體含量未有升高，后者升高 57.1%。而縮小模型實驗顯示該 IgG4 突變型抗體在相變時間為 125 min 時，聚體含量未有變化，相變時間415 min 時，聚體含量較對照品增加 100%，放大后驗證結果與縮小模型實驗結果基本一致。

3 討論

根據本文相關研究，IgG1 野生型和 IgG1 突變型分子類型的抗體原液凍融時較穩定，除不溶性微粒稍有增加外，其他質量屬性均未見明顯變化；IgG1 突變型的三種不同蛋白濃度的原液凍融時，除不溶性微粒稍有增加外，其他質量屬性并未隨蛋白濃度升高表現差異，說明 IgG1 突變型抗體原液的穩定性在凍融時受蛋白濃度影響較??；IgG4 突變型抗體原液凍融過程存在蛋白不穩定現象，主要表現為SEC-HPLC 聚體含量增加明顯，本文研究結果與文獻[5]報道結果相一致。有研究顯示，蛋白聚集一方面可能是多個蛋白質分子通過非共價鍵（范德華力、氫鍵、疏水作用和靜電作用）相連接；另一方面可能是通過二硫鍵等共價鍵相締合，稱為共價聚集[6]。這兩種聚集最終都有可能形成可溶性或不可溶性聚集物。另，本研究所用 IgG4 突變型抗體原液制劑輔料中含有甘露醇，其在低溫凍結時容易結晶析出[7]，形成的疏水性界面易引起蛋白聚集，因此輔料的差異可能也是引起聚集體增加的原因之一，讀者可進一步展開研究。

原液包裝形式、包裝規格和凍融條件的不同造成相變時間差異。同規格下在凍融袋中的相變時間小于凍存瓶，主要是因為凍融袋的比表面積大于凍存瓶，凍融過程中熱交換速率更快，蛋白在冰晶點停留的時間短，導致同等規格下凍融袋的聚體含量增加慢一些。此外凍融袋和凍存瓶材質不同，可能也是影響熱交換速率的因素之一。隨著凍存瓶和凍融袋包裝規格的增大，相變時間變長，聚體含量也隨之增加。不同冷凍條件，產品質量屬性未表現出明顯差異，可能和實驗條件設定冷凍相變時間變化太小有關，讀者可通過對凍融速率控制進一步研究不同冷凍過程對蛋白穩定性的影響；不同解凍條件，聚體含量產生明顯差異，且解凍越慢，相變時間越長，聚體含量增加越明顯。在解凍過程中，外周界面先發生熱交換，導致中心的溶質產生濃縮，發生再結晶，再結晶對冰-液界面中的蛋白質施加外界張力或剪切力，使蛋白質發生損害，產生聚集。因此慢速解凍不利于蛋白活性的恢復，推薦進行快速解凍。另，若解凍過程中有氣泡摻入也會對蛋白產生不利影響，溫和的混勻將減少再結晶，降低濃縮的影響[8-9]。

通過縮小模型確定凍融過程中蛋白質量穩定的相變時間，找到最大設計空間，使得在放大生產時所選凍融條件的相變時間落在設計空間內，并有足夠的安全系數。IgG1 抗體原液通過小試研究，其凍融過程中蛋白質量穩定的相變時間較長，放大生產時安全系數較大，凍融條件更容易滿足。而 IgG4 突變型抗體原液蛋白質量穩定的相變時間較短，安全系數空間太小，放大生產時應盡可能避免采用凍融工藝，若產品工藝必須采用凍融，應采用全自動凍融系統通過控制凍融速率或其他措施（如由凍存瓶更換為凍融袋，減小包裝規格等）嚴格控制相變時間。