細胞增殖檢測方法的研究進展

袁湘祥,徐昕榮,蔣捷新,吳春瓊,石志峰

(華南理工大學醫療器械研究檢驗中心,廣東 廣州 510006)

細胞增殖是生物體的重要生命特征,是生物體生長、發育、繁殖和遺傳的基礎.體外細胞增殖試驗通常是檢測細胞群體發生的變化或檢測分裂中的細胞數.在方法上主要是通過檢測細胞的代謝活性物、DNA合成及增殖相關抗原,進而間接了解細胞的增殖水平[1].在醫療器械領域GB/T 16886.5-2017指定體外細胞毒性試驗采用MTT法進行檢測[2].藥物篩選主要采用四甲基噻唑藍法、結晶紫染色法及SRB法進行檢測[3].在免疫學研究中,細胞增殖指數是反應機體細胞免疫應答水平的重要指標之一,CCK-8法、MTT法以及3H-TdR和BrdU法常用于免疫細胞的增殖活性檢測.在化妝品功效評價方面,細胞毒性和細胞增殖是檢測化妝品功效的基礎,也是功效原料安全劑量選擇的重要手段,具有代表性的檢測方法主要是MTT法,該試驗法是分析化合物的毒性終點試驗之一[4].近幾年報道的文獻資料中細胞增殖的檢測方法采用MTT法及CCK-8法較多,而之前的報道多采用3H-TdR法和BrdU法.3H-TdR法試驗結果重復性較差,同時還存在放射性污染,常被運用于科研,而較少運用于臨床,利用BrdU法雖可避免放射性污染,但該方法易受到外源性示蹤物的影響[5].隨著細胞增殖相關抗原物質被發現及其相應的單克隆抗體問世,該方法以其重復性高、無放射性污染、方法簡便同時可運用于石蠟切片進行觀察等優點被迅速運用于臨床[5].

不同檢測方法存在各自的優缺點,在不同的研究領域中對于細胞增殖的檢測通常會采用不同的方法,以下對此展開綜述.

1 代謝活性檢測

1.1 四甲基偶氮唑鹽法(MTT)

MTT法又稱為噻唑藍比色法,于1983年建立.MTT法是一種快速評定細胞毒性的比色分析方法,是生物材料安全性評價體系中的重要分析方法之一[6].其原理在于活細胞在代謝過程中,琥珀酸脫氫酶能將可溶性的MTT還原為可溶于二甲基亞砜(DMSO)的藍紫色甲瓚晶體,由于甲瓚的生成量與活細胞數量呈正相關,利用酶標儀測定的吸光度值可間接反應活細胞的相對數量.該方法較為簡便、安全、快捷且成本較為低廉,被廣泛運用于多種類細胞的增殖檢測、藥物篩選及細胞因子的活性檢測[7].但MTT法會因DMSO溶解甲瓚顆粒不全而導致結果重復性較差,過氧化物及重金屬也會影響該方法的準確性[8-9].該方法還廣泛運用于腫瘤放射敏感性測定、抗腫瘤藥物的大規模篩選以及生物活性因子的活性檢測等[10].在抗腫瘤藥物的篩選試驗中,運用該方法需考慮到藥物的揮發性,若未針對揮發性確定合理的試驗條件將會影響到試驗結果的準確性[11].

1.2 二甲氧唑磺比色法(XTT法)

二甲氧唑磺比色法(XTT法)在1988年由Scudiero最先報道[12].XTT法是檢測細胞增殖的另一種代謝活性物檢測方法,XTT是與MTT相類似的四唑氮衍生物,可被活細胞線粒體脫氫酶還原成水溶性黃色甲瓚,甲瓚的生成量與活細胞數量呈正相關,該方法無需溶解還原產物結晶,可直接利用酶標儀進行檢測.XTT較MTT法更為簡便、快速、數據客觀、無同位素污染、重復性較好,適用于懸浮細胞及貼壁細胞的檢測[13].該方法主要運用于多種細胞的增殖檢測、細胞毒檢測及藥物篩選等.由于XTT水溶液不穩定,因此需要低溫保存,現配現用.XTT代謝產物呈黃色,在培養過程中細胞產生的黃色代謝物或黃色試劑會影響試驗的檢測結果[14].與MTT法一樣,XTT法的檢測結果同樣易受到過氧化物的影響,從而導致試驗結果的不準確性[9].XTT法對多種腫瘤細胞的檢測效率比MTT法低,但當在檢測中加入了偶聯劑PMS時,XTT法的檢測效率將大大提高,因此該方法已逐漸受到研究者們的重視[13].

1.3 內鹽法(MTS)

內鹽法(MTS)的試驗原理與XTT法相類似,MTS是新型MTT類似物,在偶聯劑PMS的作用下可被活細胞線粒體中的多種脫氫酶還原為有色的水溶性甲瓚產物,其顏色深淺在一定范圍內與活細胞數量呈正相關性.該方法優點在于操作方法簡便、快速、特異性強、安全性高.MTS法相較于MTT法檢測結果更加準確,主要應用于細胞毒性檢測、藥物敏感性試驗及細胞增殖檢測等[15-17].

1.4 四唑單鈉鹽法(WST-1)

四唑單鈉鹽法(WST-1)與XTT法原理相類似,WST-1是與MTT類似的水溶性四唑鹽,是MTT的升級替代產品,由日本同仁化學研究所開發,經線粒體脫氫酶還原形成水溶性橙黃色甲瓚產物,甲瓚產生量與活細胞數量呈正相關,甲瓚無需后續溶解.WST-1的化學特性更加穩定,試驗產物更易溶解,實驗結果更加穩定、準確性高[18].WST-1對細胞無明顯毒性,可在多時間點反復進行數據讀取,檢測時間靈活,因此便于找到數據最佳讀取時間.

1.5 Cell Counting Kit-8(CCK-8)

CCK-8的主要成分為WST-8,WST-8檢測原理與WST-1類似,與WST-1同是由日本同仁化學研究所開發的水溶性四唑鹽,化學性質較WST-1更穩定,更易于保存.CCK-8的檢測靈敏度較MTS、XTT和MTT更高,數據重復性更好,可靠性更高,且操作簡便,對細胞無明顯毒性.CCK-8在應用上更適用于大規模藥物的篩選,細胞毒性試驗、生物活性因子的活性檢測和細胞增殖檢測[19-21].在細胞類型上,該方法更適用于懸浮細胞.由于CCK-8的細胞毒性低,因此在檢測后細胞還可重復利用,該方法相較于MTT法更具有實用性,可替代MTT法,具有更好的應用前景[22].

1.6 CFDA-SE法

羥基熒光素二乙酸鹽琥珀酰亞胺酯(CFDA-SE)是一種可穿過細胞膜的熒光染料,常用于觀察細胞的長期活動及活細胞檢測,當染料進入細胞后,細胞內的酶酯可水解其乙酸鹽基團使其轉變為具有綠色熒光的羧基熒光素琥珀酰亞胺酯,其琥珀酰亞胺基團將不可逆地與細胞內酯基結合,形成穩定的酰胺結合物.當細胞發生分裂時,CFSE標記熒光將被平均分配到兩個子代細胞中,一個連續傳代的細胞群,其熒光強度以1/2遞減,利用流式細胞儀對細胞發出的熒光信號進行收集,即可分析細胞的增殖情況.CFDA-SE檢測方法被廣泛運用于淋巴細胞增殖檢測,CFSE還可與其它抗體配合,利用流式細胞儀同時對不同淋巴細胞亞群的增殖水平進行檢測[23].

2 DNA含量檢測

2.1 胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)滲入法

胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)滲入法早期主要用于藥物敏感性實驗及細胞增殖檢測[24].該方法首先是利用氚(3H)標記的胸腺嘧啶核苷作為DNA合成的前體攝入到DNA合成的過程中,通過檢測細胞的放射強度進而間接反應細胞的增殖水平.該方法敏感度高、特異性強但該方法的檢測周期較長,不能檢測失能的T細胞且會導致檢測值偏低,同時在試驗過程中實驗人員易受到放射性危害.

2.2 2,5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)法

2,5-溴脫氧尿嘧啶核苷(BrdU)法是通過檢測細胞DNA合成進而間接反映細胞增殖水平的另一種細胞增殖測定方法.BrdU的胸腺嘧啶環上與第5位C連接的甲基被溴取代,進而形成一種胸腺嘧啶核苷類似物,在DNA合成過程中可替代脫氧胸腺嘧啶核苷攝入到新合成的DNA中,加入固定液使細胞DNA變性,利用過氧化物酶標記的抗BrdU抗體與細胞DNA上的BrdU相識別,后通過酶標儀檢測形成的免疫復合物.檢測結果OD值與細胞DNA合成量正相關,進而能間接反應細胞的增殖水平[25].該方法與胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)滲入法相比具有較多的優勢,如無需同位素放射物,OD值與細胞增殖水平強相關,檢測過程簡便快速.張為宇等[26]利用3H-TdR滲入法和BrdU法進行了同一批次的細胞增殖試驗,并對兩種試驗方法的結果進行了比較,結果表明在同一試驗中3H-TdR滲入法和BrdU法同樣敏感.

2.3 3,5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶(EdU)法

3,5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶(EdU)法與BrdU法原理類似,EdU的脫氧胸腺嘧啶環上的第5位C原子連接的甲基被乙炔基取代形成胸腺嘧啶核苷類似物,在DNA合成期(S期),可替代脫氧胸腺嘧啶核苷攝入到新合成的DNA中,利用熒光標記的BrdU抗體與BrdU結合即可反應處于增殖期的細胞.EdU的乙炔基可與熒光染料標記的小分子探針反應形成穩定的三唑環,這一反應在生物學系統中較為少見,因此該方法在檢測過程中背景干預小,敏感性高[27].EdU法相比于BrdU法檢測時間更短、更加靈敏、準確,EdU染料與BrdU抗體相比更容易穿過細胞膜,在細胞內擴散,操作中無需對DNA進行變性處理,避免DNA分子結構受到損傷,保證了DNA分子結構的完整性,能更加準確地反映DNA的復制活性.該方法更加適用于DNA修復、細胞標記示蹤和細胞增殖等方面的研究.該方法可選用激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡和流式細胞儀等進行檢測.

2.4 流式細胞術

流式細胞術是集電子技術、現代激光技術、生物學技術于一體的高通量細胞檢測技術,也是檢測細胞增殖最為準確的一種方法.其原理主要在于:帶有熒光標記的單克隆抗體與待測細胞的表面標記物相互作用或將熒光染料與細胞核核酸結合,當待測細胞經過流式細胞儀的激光束,儀器將捕捉細胞束產生的熒光信號,儀器將自動對細胞進行分類計數.碘化丙啶(PI)是流式細胞術檢測中常用的DNA染色劑,當單細胞懸液經通透處理后加入PI,當PI與DNA雙鏈結合后,此時,PI由488 nm或561 nm的激光激發,產生610～620 nm之間的發射光譜,光譜的信號強度與DNA含量成正比,該方法常被運用于細胞周期及細胞凋亡檢測[28-32].PI的優點在于其操作簡便,熒光信號穩定,CV值小,抗光漂白性良好[33].但PI與常用染料藻紅蛋白(PE)的檢測光譜重疊較高,與綠色熒光蛋白(GFP)及異硫氰酸熒光素(FITC)等染料也存在部分光譜重疊,因此,PI在使用過程中不能同時利用PE、FITC、GFP等染料標記其它指標,同時,PI染料能與雙鏈RNA結合,因此在檢測前需對樣本進行RNase處理,排除干擾[33].Hoechst 33342同樣為DNA染色劑,以非嵌入方式與DNA鏈上的A-T堿基對發生特異性結合,由355 nm紫外激光器激發,發射光譜為460 nm,該染料與488 nm激光器激發的染料不存在光譜重疊,因此在檢測過程中受其它染料光譜的影響較小[34].隨著流式細胞儀激光器配置的升級,多色檢測是今后發展的必然趨勢,由于PI與FITC、PE存在較大的光譜重疊,因此,有必要開發新的DNA染料替代PI.盧乃麗等采用流式細胞儀上更為普及的405 nm激光器替代355 nm的紫外激光器激發Hoechest 33342染色細胞DNA,最終DNA定量結果與PI染色法顯示結果基本一致,此外,Hoechest 33342染料能特異性與DNA結合,無需對樣本進行RNase處理,因此相比于PI染色而言該方法簡化了試驗步驟,是一種更值得推廣的DNA周期檢測法[35].

3 細胞增殖相關抗原檢測

3.1 Ki67

Ki67抗原于增殖期細胞的細胞核中表達,由兩條多肽鏈組成,相對分子質量分別為395 kDa和345 kDa,目前研究尚未明確其具體功能,該抗原可能是染色體支架的某種組分或是為DNA復制提供場所的核基質.Ki67抗原在除G0期、G1早期以外的其他細胞周期中表達.Ki67與腫瘤細胞的增殖密切相關,其主要運用于判定細胞的增殖活性,可用于區分正常細胞和腫瘤細胞,二者的Ki67免疫組化結果有顯著不同,該方法可運用于判定良性腫瘤與惡性腫瘤,腫瘤分型、分級及預后轉歸等.

3.2 PCNA

PCNA是與細胞分裂周期相關的核蛋白,大小為36 kDa,是細胞DNA復制過程中的關鍵因子,主要作為DNA聚合酶δ的輔助因子發揮作用.PCNA具有不可溶性和可溶性兩種,前者的含量變化與DNA合成過程一致,在G0期不表達,G1晚期表達量增加,S期表達量最高,G2至M期表達量下降.該方法可用于檢測細胞增殖過程的動態變化,對腫瘤治療的預后判斷具有重要意義[36,37].

4 小結

在醫療器械領域,體外細胞毒性是生物學評價體系中經常進行的試驗檢測項目,該試驗旨在離體狀態下模擬細胞的生長環境,檢測醫療器械產品與人體組織接觸后的生物學反應[38].目前,醫療器械生物學評價主要采用MTT法,然而醫療器械領域發展迅速,產品種類繁多,MTT法是否適合所有種類的醫療器械評價還有待于進一步研究驗證.劉永帥[39]指出MTT法運用于葡聚糖磁性納米材料的評價時會過高的評價了樣品的細胞毒性,出現假陽性結果.CCK-8法目前尚未收入到新版16886.5中,但CCK-8的確在結果的靈敏度及重復性方面比MTT法更加具有優勢,在舊版16886.5中還增加了XTT細胞毒性試驗,目前有必要針對這三種檢測方法進行深入交叉對比[2].在免疫學方面,淋巴細胞增殖活性是反映機體細胞免疫應答水平的重要指標,靜止狀態下的淋巴細胞經有絲分裂原刺激,如刀豆球蛋白、植物血凝素,可產生多克隆T、B細胞增殖、分化.經病原體感染的宿主,其淋巴細胞經體外分離后在特異性抗原的刺激作用下也可發生細胞的增殖、分化,當宿主處于免疫抑制狀態下其細胞增殖水平將減弱.在藥物篩選方面,由于組織器官和動物的篩選規模小,因此以上兩種模型主要運用于成藥后的篩選[40].在細胞水平上進行藥物篩選是最為常見的方法,在篩選上主要選取腫瘤細胞系為模型,將待篩選藥物與細胞相互作用,進而采用結晶紫染色法、SRB法、四甲基噻唑藍法檢測藥物的作用強弱[3].在化妝品安全性評價方面,細胞毒性試驗主要用于檢測化合物的遠期效應及潛在毒性,MTT法因其具有與同位素摻入法同樣的靈敏度,同時具備快速、簡便、準確的特點而得到廣泛運用,歐盟國家已將該方法列為化妝品毒理學安全程序的檢測項目之一[41].

3H-TdR滲入法由于試驗檢測過程中會產生一定的放射性,對試驗人員造成傷害,因此目前的研究中采用該方法進行檢測的較少.現如今較常用的方法主要是MTT及CCK-8,CCK-8方法對細胞毒性更低,方法更簡單、靈敏度、準確度和可重復性更高,因此該方法的利用價值更大.然而,針對淋巴細胞這種多細胞亞群的細胞增殖試驗,在同一試驗過程中不同細胞亞群的增殖水平存在差異,若需對特定亞群的增殖反應進行檢測,流式細胞術是檢測方法的首選,其它方法,例如3H-TdR滲入法、MTT法及CCK-8法通常存在非特異性、敏感性低、結果誤差大的缺點,影響試驗結果的準確性[23].

5 展望

細胞增殖檢測是評估細胞功能的重要方法,不同方法各具有優缺性,因此在針對不同檢測試驗應當對不同方法進行靈活選擇,同時應避免采用單一方法,應結合試驗要求及試驗目的選擇特異性和靈敏性較高的多種方法,以此達到方法可靠,結果準確的要求.相比于常規的檢測方法,流式細胞術最大的優勢在于多色,多參數檢測,能有效實現增殖和其他指標同時檢測或多細胞群體中單一細胞類型的增殖檢測,不同染料的染色原理不同,所使用的激光檢測通道也存在差異,可根據儀器配置及試驗方案進行選擇.隨著多色流式細胞檢測技術的不斷發展,從單一樣本中獲取更多生物信息是今后不斷發展的趨勢.