細菌脂多糖對豬圓環病毒2型在PK-15細胞中復制的影響

張歆明，徐 舸，鄭欽生，劉獻輝，張鵬飛，王爽云，張樂宜，劉燕玲，宋長緒*

(1.華南農業大學國家生豬種業工程技術研究中心，廣東廣州 510000；2.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室，廣東廣州 510000；3.華南農業大學食品學院，廣東廣州 510000)

豬圓環病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)是一種小的無襄膜的單鏈環狀DNA病毒[1]。主要引起“豬圓環病毒相關疾病”(Porcine circovirus-associated diseases,PCVAD),該病的主要臨床癥狀表現為仔豬斷奶后多系統衰竭綜合征(Post weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、豬皮炎與腎病綜合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)和繁殖障礙相關疾病,雖然針對PCV2的多種疫苗已經被廣泛使用，但是由于其復雜的免疫逃逸機制和變異株的不斷產生，致使病毒很難被有效的防控，對全世界養豬業都造成嚴重的影響。PCV2經常與許多致病菌和病毒共感染，而且與單獨感染相比，共感染表現出更加嚴重臨床癥狀。有研究表明，PCV2單獨攻毒時是很難出現典型的病理癥狀，但是在與其他病原體如豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)[2]、豬細小病毒(PPV)[3]、豬肺炎支原體(Mycoplasmal hyopneumonia)[4]，以及其他致病細菌混合感染或使用免疫刺激因子都會誘導嚴重的PMWS，這表明免疫刺激輔助因素對PCV2致病性是至關重要的[5]。

細菌脂多糖(lipoolysaccharide,LPS)存在于革蘭氏陰性菌的外膜,一般在細菌死亡后脫落下來發揮毒性作用，是免疫系統最有效的誘導因子之一[6]。其與細胞復雜的“模式識別受體”級聯識別，主要與Toll樣受體4 (TLR4)-MD2復合物結合，由LPS結合蛋白(LBP)和CD14共同催化，激活多種細胞內信號通路[7]。有報道稱LPS激活NF-κB信號通路，誘導白細胞介素(IL)-1、IL-2、IL-8，干擾素(IFN)-β和腫瘤壞死因子(TNF)-α[8]的產生。而NF-κB調節多種基因參與免疫和急性期炎癥反應和細胞生存。NF-κB信號通路的激活以及IFN-β的產生均可以促進PCV2的復制[9-11]。還有研究表明IL-2過表達后也可以促進PCV2的復制[12]。因此，刺激豬免疫系統會誘導干擾素和白介素產生可能是導致PCV2在體內復制增加的關鍵，而理論上LPS可能是通過激活NF-κB信號通路，致使免疫系統激活，促進IFN-β產生導致PCV2復制的增加。然而，我們研究發現LPS對PCV2復制的影響具有雙重效果。

本文研究LPS對PCV2復制的影響，發現 LPS的確可以顯著激活NF-κB信號通路，促進IFN-β和IL-2的表達，從而促進PCV2的復制，值得注意的是，研究發現LPS處理前期是抑制PCV2復制的，深入研究表明LPS抑制PCV2的吸附，阻止PCV2進入細胞，而后期隨著IFN-β的產生，病毒滴度又顯著升高。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和細胞 PCV2病毒，PK-15細胞，華南農業大學國家生豬種業工程技術研究中心豬病防控實驗室保存。

1.1.2 試劑 LPS(大腸埃希氏菌)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司產品；LPS(沙門氏菌)，上海善然生物科技有限公司產品；干擾素β，武漢云克隆科技股份有限公司產品；高糖DMEM培養基，胎牛血清，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產品；雙熒光報告基因試劑盒，上海碧云天生物技術有限公司產品；CCK-8細胞增殖及毒性檢測試劑盒，MCE公司產品；病毒總核酸快速抽提試劑盒，廣州美基生物科技有限公司產品；SteadyPure通用型RNA提取試劑盒，Evo M-MLV反轉錄試劑預混液，湖南艾科瑞生物工程有限公司；；Eastep?qPCR Master Mix(2X)，普洛麥格(北京)生物技術有限公司產品。

1.1.3 主要儀器 熒光定量PCR檢測儀，美國應用生物系統公司產品；細胞培養箱，賽默飛世爾科技(中國)有限公司產品；高速冷凍離心機，德國艾本德公司產品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與合成 從GenBank數據庫中下載各基因序列，并用Primer 5生物軟件設計，在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物序列和GenBank序列號見表1。

表1 引物序列

1.2.2 PK-15細胞培養 從液氮中取出凍存的PK-15細胞，37℃迅速水浴回溫，離心丟棄凍存液，加入100 g/L FBS高糖DMEM培養基，置于37℃、體積分數為5% CO2培養箱進行培養，待細胞長滿后進行傳代。細胞傳代，首先棄瓶內的培養基，用已滅菌的PBS緩沖液清洗細胞3次，加入2.5 g/L胰酶進行消化，待細胞脫落后按照1∶3比例傳代，多余細胞可進行后續細胞試驗。

1.2.3 PCV2病毒接種 待細胞長至80%～90%時進行PCV2病毒接種，用20 g/L FBS高糖DMEM培養基稀釋病毒(MOI=1的病毒感染劑量)，將病毒液完全均勻覆蓋細胞表面，放入37℃、體積分數為5% CO2培養箱進行孵育1 h，隨后用PBS緩沖液潤洗3次，換成新鮮20 g/L FBS高糖DMEM培養基維持液繼續培養。

1.2.4 LPS對PK-15細胞活力試驗 用CCK-8試劑盒進行LPS細胞毒力檢測，操作方法嚴格按照產品說明書進行，將細胞鋪到96孔板中，待細胞長至90%時，使用不同濃度的LPS(50、100、200、500、1 000、2 000 ng/mL)進行刺激，孵育24 h后，加入CCK-8試劑，37℃孵育1 h，用酶標儀在450 nm測定吸光度，對結果進行分析。

1.2.5 病毒吸附和內化試驗 將長至90%的細胞放入4℃預冷30 min，丟棄原有培養基，進行接毒，放入4℃環境中2 h，用提前預冷的PBS培養基進行潤洗3遍，清除未吸附的病毒粒子,使用病毒核酸提取試劑盒提取核酸，實時熒光定量PCR檢測吸附結果。用不同處理對病毒吸附影響試驗，處理1：用500 ng/mL的LPS在37℃孵育細胞1 h后，PBS潤洗3遍后進行吸附試驗；處理2：用50 ng/mL的LPS與PCV2病毒孵育1 h后，加入細胞中4℃孵育1 h；處理3：用500 ng/mL的LPS與PCV2病毒孵育1 h后，加入細胞中4℃孵育1 h，用實時熒光定量PCR檢測病毒拷貝數，分析試驗結果。

1.2.6 雙熒光報告基因檢測 構建靶向NF-κB和IFN-β基因的啟動子基因序列連接到pGL3-basic質粒熒光素酶表達質粒上，成功得到pGL3-basic-NF-κB和pGL3-basic-IFN-β質粒，待PK-15細胞密度在60%時，將轉錄因子表達質粒與報告基因質粒共轉染細胞內，24 h后用500 ng/mL LPS刺激細胞，收集12 h、24 h和48 h的細胞樣品，加入裂解液冰浴5 min，充分離心去細胞上清液備用，配制螢火蟲熒光素酶反應工作液和海腎熒光素酶反應液，各取100 μL先后加入到20 μL細胞裂解液中，充分振蕩混勻，反應5 min后，分別在560 nm和465 nm波長采集熒光信號，分析試驗結果。

1.2.7 實時熒光定量PCR檢測 將待測細胞培養液吸出，PBS緩沖液潤洗2遍，加入適量的細胞裂解液，隨后按照動物細胞RNA提取試劑盒操作步驟進行操作，提取細胞RNA,使用Evo M-MLV反轉錄試劑盒進行反轉錄(10 μL的體系:5× Evo M-MLVRT Master Mix 2 μL,總RNA 500 ng,無核酸酶水加至10 μL,37℃ 15 min，85℃ 5 s)，反轉錄產物作為定量檢測模板，配制定量體系，總體系20 μL(Eastep?qPCR Master Mix 2× 10 μL,DNA模板2 μL,上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,無核酸酶水7.2 μL，95℃ 2 min，40個循環，95℃ 15 s，60℃ 50 s)，放入定量PCR儀中進行擴增，分析結果。

2 結果

2.1 LPS在對PCV2在PK-15細胞復制的影響

LPS對PK-15細胞毒性試驗結果見圖1，僅在2 000 ng/mL時沙門氏菌來源的LPS出現細胞毒性，其他濃度均無明顯的細胞毒性。隨后用安全濃度為500 ng/mL的來源于大腸埃希氏菌和沙門氏菌的LPS處理細胞，驗證不同時間對PCV2復制情況的影響(圖2)，從PCV2的Cap基因的相對表達量來看,接毒后12 h，LPS均顯著抑制了PCV2的復制，而24 h和48 h又顯著促進了PCV2的復制，經3次重復，結果一致。

圖1 LPS對PK-15細胞活性的影響

圖2 不同時間點LPS對PCV2在PK-15細胞復制的影響

2.2 LPS抑制PCV2病毒的吸附

PCV2從侵入細胞到復制出新的子代病毒，至少需要18 h[13],在12 h抑制PCV2復制可通過抑制第1代PCV2病毒的吸附和內化來實現。本研究吸附試驗表明(圖3)，LPS可以抑制PCV2病毒的吸附和內化。影響PCV2吸附存在兩種可能，一是LPS直接與PCV2病毒粒子相互作用，抑制其與受體結合；或者LPS競爭PCV2的細胞受體發揮作用，為驗證LPS的作用，設計不同處理方式(圖4),與PCV2正常孵育細胞相比，用500 ng/mL LPS孵育細胞后接毒組未出現明顯差異，而LPS與PCV2孵育后接毒明顯抑制病毒的吸附,并且隨著濃度的增加，抑制效果更加明顯。表明LPS可能直接與PCV2病毒有相互作用，抑制病毒與細胞受體相互作用。

圖3 LPS對 PCV2吸附的影響

1.對照組；2.處理1；3.處理2；4.處理3

2.3 PCV2 Cap蛋白與LPS分子對接

用Pymol軟件進行分子對接，從Uniprot數據庫中查詢PCV2蛋白序列，從PubChem數據庫中下載LPS分子結構，用Pymol軟件進行預測繪制兩者相互作用圖。選取親和力較高的結果進行對接，提示兩者存在相互作用的可能，并且具有多處結合位點(圖5)。

圖5 LPS與PCV2的Cap蛋白分子對接圖

2.4 LPS促進TLR4的表達以及 NF-κB和IFN-β基因的轉錄

LPS是通過TLR4識別后，激活NF-κB信號通路，促進IFN-β產生。LPS刺激PK-15細胞后顯著促進TLR4的mRNA的表達，而PCV2感染并不影響其表達量的變化(圖6)。雙熒光報告基因試驗顯示(圖7)，與對照組相比，在LPS刺激和病毒感染后12 h和24 h，NF-κB轉錄水平明顯增加，在48 h促進效果不明顯；同時IFN-β轉錄水平在各個時間點均有明顯提高，所以LPS可以激活NF-κB和 IFN-β基因的轉錄，表明PCV2和LPS均能激活NF-κB信號通路，促進IFN-β的轉錄。

圖6 LPS促進TLR4的mRNA表達

圖7 LPS刺激與PCV2感染促進NF-κB,IFN-β基因轉錄

2.5 IFN-β促進PCV2 的復制

為了進一步驗證LPS后期促進PCV2的復制與IFN-β產生相關，用豬源的500 ng/mL IFN-β加入接毒后的PK-15細胞培養液中，結果表明，與對照組相比，PCV2的復制情況在12 h沒有明顯差異，24 h后逐漸顯現IFN-β促進PCV2復制，在48 h促進效果達到2.5倍之多(圖8)。

圖8 IFN-β處理PK-15細胞促進PCV2的復制

3 討論

PCV2病毒是目前基因組最小的病毒之一[14]，同時也是進化最成功的病毒之一，能充分利用自身遺傳序列，推測至少編碼11個開放型閱讀框(ORFs)，其中只有4個用于蛋白質的表達，分別為Cap蛋白、Rep蛋白、ORF3蛋白和ORF4蛋白，這些蛋白在滿足自身增殖功能的同時，還可以逃避宿主的先天性免疫反應[15]。PCV2被認為是免疫抑制病原體，感染后會增加感染其他病原的風險[16]。有研究稱PCV2與革蘭氏陰性菌等共同感染可能是促進PCV2復制的重要因素，至少部分地促進了PMWS的全面發展[2]。臨床上PCV2常與副豬嗜血桿菌、大腸埃希氏菌和沙門氏菌混合感染，并且表現出更加嚴重的癥狀，這其中很大程度上在于LPS引起的免疫系統的激活有關[17]。尤其是促進了IFN-β和IL-2的表達，可以顯著促進PCV2的復制，深入研究PCV2病毒可以發現，該病毒有許多異于其他病毒的地方，NF-κB信號通路激活是宿主用于清除致病微生物的利刃，但是可以被PCV2所利用，當該通路受到抑制時，反而抑制了病毒的復制。而且具有抗病毒作用的干擾素(IFNα，IFN-β，IFN-γ)及白介素(IL-2)卻可以促進病毒的復制[11,18]。

LPS作為免疫激活劑，可以激活TLR4-NF-κB信號通路從而促進IFN-β產生促進PCV2在PK-15的復制，然而，在本文中發現LPS本身可能與PCV2蛋白Cap存在相互作用，抑制PCV2被受體識別，從而達到抑制病毒吸附的效果。而且LPS與PCV2的Cap蛋白有多處結合位點，為了排除偶然性，用了來自不同細菌的LPS進行試驗，重復3次，均發現在12 h，明顯抑制PCV2的病毒滴度，這與后期的促進現象看似矛盾，卻也可以合理的解釋：在加入LPS前期，LPS與部分PCV2病毒粒子相互作用，抑制了部分病毒的吸附作用，而未相互作用的LPS與病毒粒子被相應受體識別，PCV2完成吸附和內化，釋放核酸進行后續的復制，而LPS可以促進TLR4的表達，并且通過TLR4激活NF-κB等相關信號通路，致使細胞釋放多種炎性因子，其中包括IFN-β和IL-2等，可以促進PCV2的復制，隨著LPS濃度逐漸降低和失效，后期促進效果明顯。另外，LPS與PCV2的核衣殼蛋白Cap在結構功能預測存在多處結合位點，具體機制還需進一步驗證，這一現象也為研發PCV2抗病毒藥物提供思路。

本文揭示了LPS對PCV2復制的影響，提示LPS自身存在抑制PCV2病毒吸附的功能，這將為開發抗PCV2病毒藥物提供參考。LPS會激活TLR4-NF-κB-IFN-β信號通路，促進多種炎性因子的表達，促進PCV2的復制，提示PCV2與細菌或其他病毒共感染可能會促進病毒的復制，放大免疫反應，進一步加重臨床癥狀；在構建PCV2發病模型時，加入LPS作為免疫刺激劑時，要注意引入的順序和時間。