色譜條件對果汁飲料中糖精鈉含量測定的影響

王彬，何沖，刑遼

陜西省產品質量監督檢驗研究院（西安 710048）

食品添加劑因具有防止食品腐敗變質、改善食品感官品質、提高食品營養價值[1]、增加食品種類[2-3]等功能，被譽為現代食品工業的靈魂。近年來，食品添加劑產業迅速壯大[4]。糖精鈉，學名鄰苯甲?；酋啺封c，為白色結晶性粉末，易溶于水，是常用的有機化工合成甜味劑，其甜度為蔗糖的300～500倍，可部分代替蔗糖用于飲料、蜜餞涼果、焙烤食品等。糖精鈉不被人體分解吸收，作為食品添加劑僅具備提供甜味的功能，少劑量攝入短時會隨尿液排出體外，但短時間內大量攝入糖精鈉會造成急性大出血、多臟器損害等中毒現象[5-6]。因此，精準檢測食品中糖精鈉含量的技術優化尤為關鍵。

糖精鈉含量檢測最常采用GB 5009.28—2016《食品安全國家標準食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測定》[7]中的液相色譜法，但受樣品成分、樣品性狀的干擾，按照現有色譜條件并不能準確測量果汁飲料中的糖精鈉含量。隨檢測技術的迅速提高，液相色譜串聯質譜法、氣相色譜串聯質譜法、離子色譜串質譜法等技術的運用可大幅提升糖精鈉檢測的準確性。但由于大多數檢測設備欠缺及成本限制，新型技術無法普及，液相色譜法仍是測定糖精鈉含量的常規首選方法。研究表明色譜柱是液相色譜的核心技術，選擇適宜的色譜柱可達到較好的分離效果，極大程度提高檢測的精密度[8-9]。流動相的正確選擇可有效分離待測物與雜質，縮短目標物的保留時間[10]。盧連登等[11]對比等度洗脫和梯度洗脫對黑蒜中蒜氨酸及相關硫化物含量測定的影響，結果發現等度洗脫出峰時間適宜、峰形更好、分離效果更佳。

參考GB 5009.28—2016，通過測定不同色譜柱、流動相、標準曲線范圍、洗脫方式對糖精鈉定量的影響，優化高效液相色譜法測定果汁飲料中糖精鈉含量的色譜條件，以便于更精準進行定量測定。該色譜條件的建立對常規果汁飲料中糖精鈉定量測定技術精密度的提高具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果汁飲料（北京匯源飲料食品集團有限公司）；甲醇[色譜級，賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；甲酸（優級純，上海麥克林生化科技有限公司）；乙酸銨（優級純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；糖精鈉（1 000 μg/mL，上海安譜實驗科技股份有限公司）。

1.2 儀器與設備

LC-20AD高效液相色譜儀（日本島津公司）；0.22 μm親水型PES濾頭（天津博納艾杰爾科技有限公司）；色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Poroshell 120 EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；島津ODS-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；ACE柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）。

1.3 試驗方法

1.3.1 糖精鈉標準溶液的配制

移取1.0 mL 1 000 μg/mL糖精鈉儲備液，加水定容至10 mL，配制成100 μg/mL糖精鈉標準使用液，冷藏避光保存。

1.3.2 流動相配制

乙酸銨溶液（20 mmol/L）：稱取1.54 g乙酸銨，加水定容至1 000 mL，經0.22 μm濾膜過濾。

甲酸乙酸銨溶液（2 mmol/L甲酸+20 mmol/L乙酸銨）：稱取1.54 g乙酸銨，吸取75.2 μL甲酸，加水定容至1 000 mL，經0.22 μm濾膜過濾。

1.3.3 樣品前處理

稱取2 g（精確至0.01 g）樣品，加20 mL超純水超聲溶解，移至50 mL離心管，振蕩5 min，按4 000 r/min離心10 min取上清液，再次于沉淀中加入20 mL超純水重復提取，均質離心取上清液。合并2次上清液并定容至50 mL，經0.22 μm濾膜過濾后上機測定。

1.3.4 色譜條件

色譜柱采用ACE柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為0.02 mol/L乙酸銨溶液，流動相B為甲醇-水（95∶5，V/V）；流速1.0 mL/min；檢測波長230 nm；進樣量10 μL；柱溫35 ℃；采用等梯度洗脫。

1.4 數據處理與分析

運用高效液相色譜儀LabSolutions軟件采集數據及繪制譜圖，采用JMP Pro 14.0軟件對試驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同色譜柱對糖精鈉定量測定的影響

試驗選取5種常見色譜柱，即Plus C18柱、XDB-C18柱、Poroshell 120 EC-C18柱、島津ODS-C18柱和ACE柱，參照GB 5009.28—2016的色譜條件進行對比，結果見圖1。樣品通過5種色譜柱分離，Poroshell 120 EC-C18柱因粒徑較小，流速較低，糖精鈉出峰最晚，峰形較寬，且出峰位置基線較不平穩。XDB-C18柱，糖精鈉出峰位置出現明顯干擾峰，分離效果不佳。Plus C18柱、島津ODS-C18柱和ACE柱，糖精鈉峰形均呈對稱尖銳狀，且出峰時間無明顯差異。

圖1 5種色譜柱測定糖精鈉的色譜圖

糖精鈉定量測定結果如表1所示。在不同色譜柱下糖精鈉含量的測定結果存在較大差異，最大兩組差異偏差超過10%。Plus C18柱，糖精鈉定量結果偏高，可能是由于樣品在428 nm存在吸收，無法將雜質與糖精鈉有效分離引起。ACE柱色譜柱分離測定的糖精鈉含量與真實值的偏差最小，效果最佳。其次為XDB-C18柱。

表1 5種色譜柱測定的樣品中糖精鈉含量結果（n=6）

圖2 Plus C18柱光譜對比圖

2.2 不同流動相對糖精鈉定量測定的影響

國標測定糖精鈉含量常用甲醇乙酸銨作為流動相，存在干擾峰時加入甲酸可有效分離干擾峰[12]。分別以甲醇乙酸銨溶液、甲醇+甲酸乙酸銨溶液為流動相，在相同的色譜條件下測定糖精鈉含量。結果顯示以甲醇乙酸銨、甲醇+甲酸乙酸銨作為流動相測得的糖精鈉含量與實際含量（14.486 mg/L）的偏離程度差異不大。由圖3和圖4可知，兩種流動相峰形均較好。與標準品的色譜圖對比，甲醇+甲酸乙酸銨作為流動相保留時間為10.438 min，加酸使糖精鈉的出峰時間提前，可縮短檢測時間。甲醇乙酸銨作為流動相，與雜質峰分離效果更好，基線也較為平穩，且SRSD較小，穩定性更好，因此選用甲醇乙酸銨溶液作為流動相進行果汁飲料中糖精鈉的定量測定。

表2 不同流動相測定的樣品中糖精鈉含量結果（n=6）

圖3 甲醇乙酸銨溶液作為流動相時標準品與樣品對比圖譜

圖4 甲醇+甲酸乙酸銨溶液作為流動相時標準品與樣品對比圖譜

2.3 不同標準曲線范圍對糖精鈉定量測定的影響

分別配制1，5，10，20，50，100，200 μg/mL系列和5，10，15，20，30，50 μg/mL系列的糖精鈉標準溶液，以這2種標準曲線對樣品進行定量測定，結果見表3。結果表明，XDB-C18柱和ACE柱均在5～50 μg/mL線性范圍內糖精鈉含量測定結果與真實值偏差較小，為保障測定結果更加準確，應適當縮小線性范圍，且嚴格控制待測樣品濃度在線性范圍內。

表3 不同標準曲線范圍測定的樣品中糖精鈉含量結果（n=6）

2.4 梯度洗脫和等度洗脫對糖精鈉定量測定的影響

采取GB 2760—2014檢測條件，選用ACE色譜柱對比等度洗脫和梯度洗脫，測定的糖精鈉含量結果見表5。實際工作中測定樣品種類復雜，大批量進樣時雜質洗脫效果不佳，保留在色譜柱內極大降低分離效率，且容易造成堵塞。而梯度洗脫可有效洗脫雜質，延長色譜柱壽命，改善待測物峰形，減少長時進樣保留時間漂移等問題[13]。對比2種洗脫程序色譜圖發現，待測物均能較好地與雜質峰分離，且峰形較好，基線均平穩，保留時間差別不大。采用梯度洗脫及等度洗脫糖精鈉定量的結果偏差均小于0.5%，但梯度洗脫結果準確性略高，且SRSD值較小，穩定性更好。

表5 不同洗脫程序樣品中糖精鈉含量結果（n=6）

圖5 等度洗脫程序下測得的樣品色譜圖

圖6 梯度洗脫程序下測得的樣品色譜圖

表4 梯度洗脫程序

2.5 質控樣品中糖精鈉含量測定結果對比

質控樣品測定是衡量檢測準確性的重要標準，有助于進行糾偏分析，提升實驗室的檢測能力[14]。采用試驗確定的最佳色譜條件，選用XDB-C18柱、ACE柱對質控樣品中糖精鈉含量進行測定，結果見表6。ACE柱測得的結果更接近真實值，且偏差更小。但2種色譜柱測定的糖精鈉含量結果差異不大明顯，偏差約0.5%，證實所篩選的色譜條件具有穩定可靠性。

表6 質控樣品中糖精鈉含量測定結果（n=6）

2.6 果汁飲料中糖精鈉加標回收情況

選擇一款食品標簽上不含糖精鈉的果汁飲料（匯源果汁），按照上述步驟制樣，在制得的樣液中分別加入7，14和28 mg/L的糖精鈉標準溶液，加標回收試驗結果見表7。結果表明不同加標量水平的回收率均在95%～100%之間，SRSD均小于0.5%，表明該方法精確度高，準確性好，能夠較準確地對果汁飲料中糖精鈉進行定量測定。

表7 果汁飲料中糖精鈉回收率和精密度試驗結果（n=6）

3 結論

在GB 5009.28—2016基礎上，通過測定不同色譜條件對糖精鈉定量的影響，優化一系列可準確定量果汁飲料中糖精鈉含量的色譜條件。選用ACE色譜柱，流動相為甲醇乙酸銨溶液，標準曲線取值范圍5～50 μg/mL，采用梯度洗脫時，回收率在95%～100%之間，SRSD值小于0.5%。該色譜條件精確度高，能準確對糖精鈉進行定量測定，為日常果汁飲料中糖精鈉含量的實際測定提供一定理論支撐與技術保障。