清香型白酒發酵過程中高級醇形成規律

任宇婷，喬美靈，孫子羽，張桂蓮，滿都拉*，陳忠軍*

1(內蒙古農業大學 食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特，010018)2(內蒙古池園酒業有限公司，內蒙古 呼和浩特，011500)

高級醇又稱雜醇油(higher alcohols)，是指碳原子數大于2的醇類，具有醇甜和助香功能，同時也是形成酯類和醛類等風味物質的重要前體，在酒類風味物質組成中占有重要地位。白酒中常見的高級醇包括正丙醇、正丁醇、異丁醇、異戊醇、活性戊醇、己醇和苯乙醇等。研究發現，高級醇代謝途徑主要有氨基酸降解途徑(Ehrlich pathway)和合成代謝途徑(Harris pathway)(圖1)。其中，Ehrlich pathway是支鏈氨基酸在轉氨酶作用下形成相應的α-酮酸，α-酮酸經脫羧和還原，形成比原氨基酸少一個碳的高級醇[1]。如蘇氨酸(Thr)生成正丙醇、亮氨酸(Leu)生成異戊醇、纈氨酸(Val)生成異丁醇、異亮氨酸(Ile)生成活性戊醇(2-甲基丁醇)、苯丙氨酸(Phe)生成苯乙醇等[2-3]。Harris pathway是由糖通過糖酵解途徑生成丙酮酸(α-酮酸)，丙酮酸經脫羧還原形成高級醇[4]。

圖1 高級醇代謝途徑

氨基酸是微生物生長代謝所需氮源之一，在發酵過程中主要由蛋白質經芽孢桿菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物和酶作用下代謝生成[5-6]。當游離氨基酸含量較高時酵母菌主要利用Ehrlich pathway合成高級醇，而游離氨基酸耗盡時主要利用Harris pathway合成高級醇[7]。在葡萄酒發酵過程中添加丙氨酸(Ala)和纈氨酸(Val)能顯著增加異丁醇的含量[8]。黃酒釀造中添加纈氨酸(Val)可增加異丁醇和異戊醇的含量[9]。因此，氨基酸種類和含量是影響酒類發酵過程中高級醇生成的重要因素之一[10-12]。

微生物合成高級醇的生理目的之一是平衡細胞內的氧化還原穩態，即將NADH的H+傳遞給醛轉變為醇，以平衡NADH/NAD+的比例[13]。因此，氧化還原狀態是影響微生物合成高級醇的另一重要原因。目前清香型白酒發酵過程中游離氨基酸含量變化，以及在混合微生物作用下游離氨基酸與高級醇合成的相關性尚不清楚，并且在發酵過程中Ehrlich pathway和Harris pathway對高級醇合成的貢獻性尚不明確?；谝陨?，本研究以清香型白酒為研究對象，通過測定發酵過程中高級醇含量、氧化還原電位和游離氨基酸含量變化，分析高級醇與氧化還原電位和游離氨基酸之間的關系，探究清香型白酒發酵過程中高級醇生成規律。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本采集

酒醅樣品采集于北方某清香型白酒廠，地缸發酵，采集發酵周期為28 d的大楂樣品，采集時間為發酵 0、3、5、7、10、12、15、18、21、24、28 d，每個時間點分別采集3個發酵缸的酒醅樣品。

1.1.2 試劑和儀器

鹽酸、氯化鈉、磷酸(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；磺基水楊酸，天津永晟精細化工有限公司；標準品Amino Acids Mixture Standard Solution(Type H)，日立高新科學公司；仲辛醇(色譜純)，上海易恩化學技術有限公司；甲醇(色譜純)，賽默飛世爾科技公司。

TR-901土壤ORP電位計，上海儀電科學儀器股份有限公司；SCIENTZ-IID超聲破碎儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；3-18KS Sigma高速離心機，上海成貫儀器有限公司；LA8080高速氨基酸自動分析儀，日立高新科學公司；TriPlus 500VL頂空進樣器、Trace 1300氣相色譜儀、ISQ7000質譜儀，賽默飛世爾科技公司；BCD-249CF美菱冰箱，合肥美菱股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高級醇含量測定

準確稱取2.5 g(準確至0.01 g)酒醅樣品到頂空瓶中，加入10 mL基體改性劑；并加入10 μL的內標溶液(2.2 g/L)，立即擰緊瓶蓋，混勻待測。GC-MS測定條件[14]：初始溫度為35 ℃，保持2 min，以5 ℃/min的速率升高至150 ℃并保持5 min，再以5 ℃/min 的速率升高至230 ℃ 并保持2 min。載氣為高純度氦氣，氣體流速為1.0 mL/min，進樣器溫度250 ℃，傳輸線溫度260 ℃，離子源溫度280 ℃。質譜儀EI發射電流為50 μA，EI的離子能量為70 eV。m/z掃描35～450 amu的總離子流，使用NIST 2.3譜庫比對。進樣方式為不分流進樣，進樣量為1.0 mL。根據GC-MS 檢測的高級醇和內標的峰面積計算不同發酵時期酒醅中高級醇含量。

1.2.2 氧化還原電位測定

取樣前使用土壤ORP電位計測定酒醅氧化還原電位，參比電極位于發酵缸中心位置，ORP電極位于參比電極兩側并且與參比電極的距離相等，待儀器測定數值鎖定后記錄數值。

1.2.3 游離氨基酸含量測定

稱取1 g(準確至0.01 g)酒醅樣品，準確加入5 mL水，在25 ℃條件下超聲處理10 min(100 W，40 kHz)，于10 000 r/min離心10 min。取上清液5 mL加入5 mL 10%磺基水楊酸，混合均勻置4 ℃冰箱冷藏靜置60～120 min，于12 000 r/min離心15 min，取上清液經0.22 μm濾膜過濾后上機分析[5]。使用高速氨基酸分析儀測定酒醅中游離氨基酸含量。以峰面積定量，根據標準氨基酸的校正因子和樣品稀釋因子計算酒醅中氨基酸的含量。

1.2.4 統計分析

使用SPSS 24.0對氧化還原電位、高級醇和游離氨基酸含量進行單因素方差分析和聚類分析，使用R語言(Psych)計算Spearman相關性系數，使用Origin Lab 2017及R語言(ggplot2)繪圖。

2 結果與分析

2.1 發酵過程中高級醇含量變化

在整個發酵過程中，高級醇含量在發酵0 d時最低，發酵0～3 d含量迅速升高，此后隨發酵進行呈現先降低再增加的規律，不同高級醇最高含量出現時間有所不同(圖2)。丙醇在發酵0 d時未檢測出，在發酵3 d時達到最高(360.89 μg/kg)，發酵28 d時含量為269.37 μg/kg。異戊醇和異丁醇在發酵24 d時含量最高(5 163.06、3 310.56 μg/kg)，此后略有下降，發酵28 d時含量分別為5 091.24、3 100.37 μg/kg。2-甲基丁醇(活性戊醇)在發酵7 d時含量最高(1 437.46 μg/kg)，發酵28 d時含量為1 350.88 μg/kg。苯乙醇在發酵28 d時含量最高為279.36 μg/kg。正戊醇、正丁醇和正己醇的含量相對較低，在發酵24 d時含量最高(7.88、26.22、33.26 μg/kg)，此后略有下降，發酵28 d時含量分別為7.46、24.64、29.57 μg/kg。整體來看，在發酵結束時(發酵28 d)各高級醇累計含量之間的關系為異戊醇>異丁醇>2-甲基丁醇>丙醇> 苯乙醇>正己醇>正丁醇>正戊醇。

圖2 不同發酵時期酒醅高級醇含量

通過比較單位發酵時間內高級醇的積累量發現，發酵0～3 d高級醇的變化最大，遠高于其他發酵階段。發酵0～3 d、5～7 d和18～24 d是高級醇主要產生的3個階段，其中發酵0～3 d為高級醇合成主要階段，而發酵3～5 d和10～15 d為高級醇主要減少的兩個階段(圖3)。苯乙醇在發酵18～21 d時積累最快，其余高級醇在發酵前期(0～3 d)積累最快。研究表明固態發酵白酒的高級醇含量會隨發酵時間的增加呈現上升趨勢[12,14-15]。本研究中，高級醇在發酵0～3 d積累最快，正戊醇、正丁醇和正己醇的含量在發酵周期內含量遠低于其他高級醇，且存在較大波動。白酒釀造中化學因素(乙醇和還原糖)對微生物的影響較大，而微生物種類和數量又影響環境因素的改變[16]。酵母是產高級醇的主要微生物，其豐度隨發酵發生改變，并且在清香型白酒中發現酵母和細菌“二次增長”的現象[17]。因此，高級醇含量隨發酵進行呈現波動變化，可能與發酵過程中多種微生物參與和環境因素有關。

圖3 單位時間內高級醇含量的平均變化

2.2 發酵過程中氧化還原電位變化

為探究整個發酵過程中氧化還原狀態，對整個發酵過程中氧化還原電位(Eh)的變化進行跟蹤測定，結果如圖4所示。發酵0 d時Eh最高(391.50 mV)，發酵3 d時Eh最低(223.67 mV)，此后隨發酵進行氧化還原電位不斷增加，并在發酵24～28 d穩定[(350±1) mV]。發酵0～5 d Eh差異顯著(P<0.05)，發酵7～21 d、發酵24～28 d Eh差異不顯著(P>0.05)。發酵起始時Eh較高，此時氧氣含量較高，隨著發酵的進行，好氧微生物繁殖使環境的氧含量下降，使得Eh快速下降，而后隨發酵進行產生氧化態物質，使得Eh再次升高[18]。

圖4 不同發酵時期酒醅氧化還原電位變化

微生物合成高級醇的生理功能相關研究顯示，高級醇可以抑制其他微生物的生長[19]、平衡微生物的氧化還原穩定[20]和作為信號物質引誘捕食者的作用[21]。其中，維持細胞內氧化還原態的穩定性可能是白酒發酵中微生物合成高級醇的主要目的。由醛生成醇的過程需要輔酶NADH的參與，NADH經氧化產生H+和NAD+，H+與醛結合生成相應的高級醇。在有氧條件下有利于NAD+向NADH生成，如NADH可在碳水化合物、脂肪、蛋白質代謝等途徑中生成，而較高含量的NADH可促進高級醇的生成[13, 22]。發酵起始Eh值高為微生物生長提供有利環境，使得酒醅原料得以降解，在碳水化合物、脂肪、蛋白質代謝等途徑中獲得NADH。因此，在白酒發酵前期氧氣可能是產生大量高級醇的主要驅動因素。隨發酵進行，酒醅中的氧氣被利用，微生物代謝所產生的還原態物質增加，使得Eh下降，高級醇合成速率降低。發酵后期隨Eh再次升高，并且酵母菌作為優勢微生物存在[23]，可能是發酵后期高級醇含量再次上升的原因。

2.3 發酵過程中游離氨基酸含量變化

從整個發酵過程來看，17種游離氨基酸中有16種游離氨基酸的含量在發酵0～3 d迅速升高(P<0.05)，并隨發酵進行整體呈現上升趨勢，只有精氨酸(Arg)含量隨發酵進行下降(圖5)。高級醇合成的前體氨基酸，亮氨酸(Leu)、纈氨酸(Val)、蘇氨酸(Thr)和異亮氨酸(Ile)在發酵28 d時含量最高為4.39、4.03、3.09、2.29 mg/100g，但苯丙氨酸(Phe)在發酵15 d時含量達到最高(3.35 mg/100g)。此外，丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Glu)、賴氨酸(Lys)、甘氨酸(Gly)、酪氨酸(Tyr)、天冬氨酸(Asp)、絲氨酸(Ser)、組氨酸(His)和蛋氨酸(Met)含量在發酵28 d時達到最高，分別為7.53、6.13、5.24、2.35、2.12、1.82、1.56、1.07、0.69 mg/100g。半胱氨酸(Cys)在發酵10 d時含量最高(0.43 mg/100g)。脯氨酸(Pro)在發酵18 d時含量最高(4.88 mg/100g)，精氨酸(Arg)在發酵0 d時含量最高(0.42 mg/100g)。綜上所述，酒醅發酵過程中游離氨基酸含量隨發酵進行整體呈現上升趨勢，并且有13種游離氨基酸含量在發酵28 d達到最高。

a-Thr、Val、Ile、Leu、Phe;b-Glu、Ala、Lys、Pro；c-Asp、Ser、Gly、Cys、Met、Tyr、His、Arg

報道顯示，在白酒發酵過程中游離氨基酸主要在堆積發酵和窖池發酵過程產生，并且大多數游離氨基酸的含量逐步增加[24]。糖化階段和入池發酵前期是白酒釀造過程中Tyr和Phe的主要生成階段[25]。對青稞酒和黃酒發酵過程中游離氨基酸研究表明，其總含量隨發酵時間的增加而增加[5, 26]。本研究中共有16種游離氨基酸含量隨發酵時間的增加逐步增加，這與前人的研究結果類似。發酵前期微生物大量增殖，蛋白質在芽孢桿菌、乳酸菌、醋酸菌等微生物和酶的作用下水解產生游離氨基酸是造成發酵前期游離氨基酸含量迅速上升的主要原因[5-6]。

2.4 高級醇和游離氨基酸聚類分析

發酵過程中高級醇游離氨基酸聚類分析結果如圖6所示?；诟呒壌己康木垲惙治隹蓪l酵過程分為2個大類(圖6-a)，第1類由發酵0 d組成，第2類由發酵3、5、7、10、12、15、18、21、24、28 d組成，這一結果也進一步說明發酵前與發酵后高級醇含量存在顯著不同?；谟坞x氨基酸含量的聚類分析可將發酵過程分為3個大類(圖6-b)，第1類由發酵0 d組成，該時間點的游離氨基酸含量最低。第2類由發酵3、5、7 d組成，該時間段內游離氨基酸含量不斷增加，說明隨發酵進行微生物大量繁殖并代謝產生了游離氨基酸，使得游離氨基酸含量增加。第3類由發酵10、12、15、18、21、24、28 d組成，該時間段內大多數游離氨基酸含量呈現先降低后升高的規律。

a-高級醇；b-游離氨基酸

2.5 發酵過程中游離氨基酸與高級醇的相關性分析

為進一步明確發酵過程中高級醇與游離氨基酸之間的關系，利用Spearman相關系數計算發酵過程中高級醇與游離氨基酸之間的相關性。部分高級醇與游離氨基酸具有顯著正相關性(P<0.05)。雖然游離氨基酸與高級醇之間相關性顯著，但是從相關系數看(|r|<0.5)，相關關系程度普遍較弱(圖7)。本研究選取具有中等相關性的(|r|>0.4)高級醇與游離氨基酸進行了進一步的分析。結果顯示，異戊醇與Gly和Ala，正丁醇與Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Val、Met、Leu、Lys和His，正戊醇與Asp、Thr、Ser、Glu、Gly、Ala、Val、Met、Ile、Leu、Lys和His，苯乙醇與Asp、Thr、Ser、Gly、Val、Met、Ile、Leu、Lys和His，丙醇與Cys均呈顯著正相關(P<0.05)，苯乙醇與Arg呈顯著負相關(P<0.05)。

圖7 高級醇與游離氨基酸相關性分析熱圖

酵母代謝中特定的氨基酸可以通過氨基酸降解代謝途徑形成特定的高級醇，如Thr生成正丙醇、Leu生成異戊醇、Val生成異丁醇、Ile生成活性戊醇(2-甲基丁醇)、Phe生成苯乙醇、Tyr生成酪醇、Trp生成色醇等[2-3]。張文葉等[27]研究表明在山楂酒發酵中Val、Phe和Leu通過分解代謝生成對應高級醇，且Gly可作為異戊醇的前體物質在發酵中使異戊醇含量升高。在黃酒釀造中添加Val增加了異丁醇和異戊醇的含量[9]。在果酒發酵中，氨基酸在第一階段可被完全消耗掉[28]，但在固態發酵白酒中，游離氨基酸逐步產生并且含量隨發酵的進行而增加[5, 26]。本研究中游離氨基酸含量隨發酵呈現積累的趨勢，說明有氨基酸源源不斷的產生。因此，可以進一步推斷在后期發酵過程中，由氨基酸代謝途徑產生高級醇的可能性較大。此外，高粱中Asp、Glu、Pro、Ala、Val、Leu和Phe含量較高[29]，這些都是高級合成的直接前體，且氨基酸間的相互轉化也改變氨基酸的種類和含量，這可能是使得非高級醇合成前體氨基酸與高級醇存在相關性的一個原因。由于白酒發酵涉及眾多微生物參與，高級醇的代謝更為復雜多樣，需要進一步利用其他策略深入研究。

3 結論與討論

高級醇作為酒類中重要的風味物質，其形成規律一直是該領域的研究熱點。由多種微生物參與的傳統白酒發酵過程中高級醇合成規律更為復雜多變。本研究從高級醇合成的環境條件(氧化還原電位)和物質條件(游離氨基酸)兩個角度分析傳統清香型白酒發酵過程中高級醇合成規律。結果顯示，高級醇含量在發酵0～3 d快速升高，并且發酵0～3 d是高級醇合成的主要階段，但發酵3～5 d和10～12 d時高級醇含量有所下降。研究表明，高級醇在酶的作用下可轉化為醛或酸[30]或與酸類物質形成酯類[31]，且乳酸菌能夠降低高級醇的含量[15]。因此，微生物和酶的作用可能使得高級醇含量下降。Eh在發酵0 d時最高，說明發酵0 d適合好氧微生物的繁殖代謝。并且有氧條件下有利于環境中NAD+向NADH轉化，較高含量的NADH可促進高級醇的生成，并達到平衡NADH/NAD+比例的目的[13,22]。游離氨基酸含量在發酵0 d時較低(0～1.8 mg/100g)，隨發酵進行游離氨基酸逐漸積累。相關性結果表明異戊醇、正丁醇、正戊醇、苯乙醇和丙醇均與游離氨基酸呈現顯著相關。

研究表明高級醇合成途徑與游離氨基酸的含量有關，當游離氨基酸缺乏時，釀酒酵母主要通過Harris pathway形成高級醇，當游離氨基酸濃度較高，主要通過Ehrlich pathway形成高級醇[7]。而在發酵0 d Eh值較高，游離氨基酸含量較低。此外，取樣的生產企業白酒生產工藝中有堆積過程，即在入缸發酵前低溫大曲與原料混合后堆放一段時間，在這一過程中淀粉開始降解[32]。經測定發現，在發酵0 d時還原糖含量為4.21%，高于其他發酵時間，這為發酵初始階段由Harris pathway途徑合成高級醇提供有利條件?；谝陨?，推測發酵初期受氧氣、游離氨基酸的低含量和還原糖的高含量的影響使得高級醇主要通過Harris pathway途徑合成。但白酒發酵是一個復雜的生物轉化過程，除釀酒酵母以外，其他微生物也具有產高級醇的能力，解析混合微生物發酵過程中高級醇合成規律有待進一步深入研究。