糖腎方通過調節脂質自噬減少非酒精性脂肪性肝病小鼠肝臟脂質沉積

楊景舒，楊 猛，李 平，趙海玲，孫秋月，武曦藹，楊 鑫，張 韞，龔文心，程思益，李 忻*

（1.北京中醫藥大學 中日友好醫院臨床醫學院，北京 100029；2.中日友好醫院 普外乳甲外科，北京 100029；3.中日友好醫院臨床醫學研究所，北京 100029；4.中日友好醫院 內分泌科二病區，北京 100029）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指排除過量飲酒史而出現肝細胞內脂質代謝紊亂和脂肪蓄積，常伴有肥胖、糖尿病、高脂血癥、高血壓等代謝異常[1]。研究顯示，全球NAFLD 患者占總人口的32.4%，且呈現持續增長的趨勢[2]。目前，NAFLD 的病因尚不明確，臨床上沒有標準的治療藥物，流行病學調查研究結果認為其可能與遺傳、飲食結構、運動缺乏和菌群失調等因素有關[3]。自噬是一種自我降解過程，通過消除多余的細胞器或大分子物質來維持細胞和生物體穩態。自噬的功能異常與糖尿病、肥胖、NAFLD、高脂血癥等多種代謝疾病相關[4]。研究表明，自噬障礙能夠引起肝臟脂質沉積，導致NAFLD 發生[5]。鑒于自噬在NAFLD 中的關鍵作用，調節自噬可能是治療NAFLD的潛在策略。

糖腎方顆粒劑（Tangshen Formula，TSF）由黃芪、生地黃、山茱萸、枳殼、鬼箭羽、三七和熟大黃按照一定比例配制而成，具有益氣柔肝、活血通絡之功效。臨床研究發現，TSF 可提高糖尿病患者血清高密度脂蛋白、降低血清低密度脂蛋白及甘油三酯水平[6]。前期研究觀察到TSF 可以顯著減少2型糖尿病小鼠肝臟中的脂質堆積，對血清中的谷丙轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase，ALT）、谷草轉氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase，AST）等標志物進行調控，同時還能調整調節甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）的代謝失調[7]，但其具體分子機制還需進一步探討?；诖?，我們使用NAFLD 小鼠模型來研究TSF對NAFLD的治療效果和可能的機制。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級雄性C57BL/6J 小鼠24 只，8 周齡，購自北京華阜康實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0008。飼養于中日友好醫院臨床醫學研究所實驗動物平臺，實驗動物許可證號：SYXK（京）2023-0001，濕度（55±15%）和溫度（23±3°C）環境，所有實驗及操作遵循《實驗動物管理條例》進行。本實驗通過中日友好醫院臨床醫學研究所實驗動物倫理審批，批號：zryhyy21-21-01-15。

1.2 藥物與試劑

TSF 顆粒購自北京亞東制藥有限公司。蘇木素-伊紅（HE）以及油紅O 染色試劑購自索萊寶生物科技有限公司。LC3B 抗體購自美國Sigma 公司，p62 抗體購于日本MBL 公司，SIRT1、mTOR 和p-mTOR 的抗體購自美國Santa Cruz 公司和Cell Signaling Technology公司。

2 方法

2.1 實驗分組及糖腎方（TSF）干預

選取健康SPF 級8 周齡C57BL/6J 小鼠24 只，適應性喂養后隨機分為4 組（每組6 只）：對照組（ND）、對照+TSF 組（ND+TSF）、模型組（HFD）、模型+TSF 組（HFD+TSF）。對照組和對照+TSF 組小鼠給予正常飲食（normal diet，ND），模型組和模型+TSF 組小鼠給予高脂飲食（high fat diet，HFD）。各組小鼠均自由獲得飲用水及食物。造模4周后對ND+TSF組、HFD+TSF組小鼠進行TSF（2.4g/kg/d）灌胃，治療12周。實驗結束前，所有小鼠被禁食12h后處置，采集血清和肝臟組織。

2.2 肝組織病理學檢測

HE 染色：小鼠肝臟右葉浸泡于4%多聚甲醛溶液中固定24h。隨后，將組織包埋在石蠟中，并進一步切割成厚度約為5μm 的薄片。用HE 進行染色處理。染色完成后的切片經過脫水和封閉步驟后在顯微鏡下觀察。

油紅O染色：將冷凍包埋的肝臟組織冰凍切片干燥處理后，切片用油紅O 浸染20min，使用60%的異丙醇溶液分化，再用蘇木素染色小鼠肝臟組織中的細胞核1min 并進行返藍處理。染色完成后，用甘油封閉切片，并在顯微鏡下進行觀察。

2.3 血清生化指標檢測

各組小鼠采用1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后眼球取血，離心分離血清，全自動生化分析儀測定小鼠血清ALT、AST、TC和TG的表達水平。

2.4 Western Blot檢測自噬相關蛋白表達

采用免疫印跡法（Western blot）檢測自噬標記物LC3B-Ⅰ/Ⅱ、自噬底物p62、沉默信息調節因子（silent information regulator 1，SIRT1）及自噬上游關鍵分子mTOR 等的表達。每個樣本肝組織稱取50mg，并采用RIPA 裂解液對其進行完全裂解。完成后，對樣本進行離心后取上清液，進一步使用BCA 方法評估其蛋白含量。隨后，采用6%～12.5%的SDS-PAGE 凝膠對蛋白進行電泳分離，并將其轉移到PVDF 膜上。5%脫脂奶粉對PVDF膜室溫封閉2h，在常溫下分別加入β-actin（1∶3000）、LC3B（1∶2000）、P62（1∶2000）、SIRT1（1∶1000）、p-mTOR（1∶1000）和mTOR（1∶1000）抗體孵育2h。放置搖床上使用TBST 洗滌后，加入二抗IgG 抗體（1∶3000），在常溫下孵育1.5h。TBST洗滌后，用ECL 試劑進行顯影，并通過Bio-Rad 設備獲取圖像。最后，采用ImageJ 軟件分析條帶的灰度值，以β-actin 作為參照標準，目標蛋白表達以相對灰度表示。

2.5 統計學方法

本實驗所得數據采用GraphPad Prism 8.3 軟件進行統計分析，以均數±標準誤差表示，多組間比較用One-way ANOVA 檢驗分析，方差分析有統計學意義時采用Tukey 法進行兩兩比較。P<0.05認為具有統計學意義。

3 結果

3.1 糖腎方（TSF）對NAFLD 小鼠血清ALT、AST、 TC和TG水平的影響

與正常飼料喂養的ND 組小鼠相比，高脂飼料喂養的HFD 組小鼠血清中的ALT、AST、TC 和TG 水平明顯升高，（P<0.05，P<0.01）；與HFD 組比較，HFD+TSF 組的ALT、AST、TC 和TG 水平顯著降低（P<0.05，P<0.01），見表1。

表1 TSF對NAFLD小鼠血生化水平的影響（n=6，±s）

表1 TSF對NAFLD小鼠血生化水平的影響（n=6，±s）

注：與ND 組比較，# P<0.05，## P<0.01；HFD+TSF 組與HFD 組比較，* P<0.05，** P<0.01

TC（mmol/L）2.36±0.22 2.32±0.84 4.31±0.79##3.03±1.02*TG（mmol/L）0.68±0.11 0.64±0.23 1.30±0.25##0.89±0.18**組別ND ND+TSF HFD HFD+TSF ALT（IU/L）50.33±6.62 48.17±11.02 152.83±34.95##107.33±22.62##**AST（IU/L）129.67±24.01 126.17±27.67 179.67±27.29#135.83±22.12*

3.2 糖腎方（TSF）對NAFLD 小鼠肝組織病理形態學的影響

HE染色顯示，ND 組中的肝細胞結構完好，從中央靜脈開始向外輻射，整齊有序地排列，肝小葉的形態清晰。而HFD 組的小鼠肝小葉結構損壞、界限模糊，且肝細胞變得腫大，出現脂肪空泡以及炎癥細胞滲透和部分肝細胞壞死。HFD+TSF 組的小鼠肝細胞形態相對于HFD 組有明顯改善，其病理損傷較輕，脂肪空泡數量和大小都顯著減少。見圖1（封三）。

圖1 各組小鼠肝組織病理形態變化 （×400）

在油紅O 染色中，ND 組小鼠肝細胞結構正常，胞質呈淡藍色，基本沒有橙紅色的脂滴；HFD組肝組織中廣泛分布有大量、體積較大的橙紅色脂滴，其中部分脂滴甚至融合成片狀，說明肝組織中有嚴重的脂質沉積；相較于HFD 組，HFD+TSF組的肝臟脂質沉積明顯減輕，見圖1（封三）。

3.3 糖腎方（TSF）對NAFLD 小鼠肝組織自噬相關蛋白表達的影響

Western blot 結果顯示，與ND 組相比，HFD組肝臟SIRT1、LC3B-Ⅱ蛋白表達水平明顯下降（P<0.01），p-mTOR、p62 蛋白表達水平明顯上調（P<0.01）；經過TSF處理后，與HFD組相比，HFD+TSF 組小鼠肝臟p-mTOR/mTOR 蛋白表達水平比值和SIRT1、LC3B-Ⅱ、p62 蛋白表達水平得到恢復（P<0.05，P<0.01），見表2、圖2。

表2 TSF對自噬相關蛋白表達的影響 （n=6，±s）

表2 TSF對自噬相關蛋白表達的影響 （n=6，±s）

注：HFD 組與ND 組比較，## P<0.01；HFD+TSF 組與HFD 組比較，* P<0.05，** P<0.01

LC3B-Ⅱ（%）1.56±0.05 1.53±0.15 0.56±0.03##1.31±0.25**P62（%）0.44±0.1 0.46±0.04 0.82±0.06##0.58±0.08*SIRT1（%）0.68±0.05 0.53±0.11 0.21±0.06##0.39±0.03*p-mTOR/mTOR（%）0.51±0.04 0.51±0.11 1.19±0.15##0.81±0.14*組別ND ND+TSF HFD HFD+TSF

圖2 TSF對自噬相關蛋白表達影響的Western blot結果

4 討論

NAFLD 是一種復雜的慢性肝病，常與肥胖、糖尿病和高脂血癥等疾病密切相關，其發病率逐年增加。對于NAFLD，西醫尚無有效的藥物治療，治療多為干預生活方式及調節代謝水平，但治療效果不佳，因此尋找有效的治療手段日益迫切。中醫學并無NAFLD 這一病名，根據NAFLD 的臨床表現可將此病歸屬“肝癖”“肋痛”“肥胖”等病癥范疇[8]。此類疾病常因飲食不節，勞逸失常等誘發，病機總屬本虛標實，以臟腑功能失調為本，痰濕瘀為標，氣機運行不暢，脂肪積聚于肝臟，進而形成脂質沉積[9]。治療NAFLD 可使用益氣柔肝，活血通絡的方法[10]。TSF 以黃芪為君，補氣升陽，利水消腫；生地清熱涼血，三七與鬼箭羽活血化瘀，逐血通經，大黃清熱瀉火，涼血解毒，四藥為臣，與黃芪共奏陰陽調劑，補而不行滯；山萸肉、枳殼為佐藥，二者收斂固澀，理氣行滯，共同調暢氣機[11]。方中三補四瀉，起到扶正祛邪，攻補兼用的功效，既補氣陰之不足又祛瘀濁之有余，達到益氣柔肝、活血通絡之效[12]。在本次實驗中，我們使用高脂飲食喂養的方法構建NAFLD 小鼠模型。模型組小鼠血清中ALT、AST、TC 和TG 的水平明顯提高，其肝臟組織出現炎性浸潤、脂肪變性和脂質沉積等病理變化，這些指標均提示模型建立成功。實驗數據進一步顯示，糖腎方（TSF）能有效降低NAFLD 小鼠的血生化指標，并減輕其肝臟中的脂肪積累，證實具有益氣柔肝、活血通絡作用的TSF對NAFLD模型小鼠療效顯著。

盡管已有大量研究關注NAFLD 的發病原因，但其確切的發病機制尚不完全清楚[13]。近年來，自噬在NAFLD 的發病機制中的作用受到了廣泛關注。自噬是溶酶體介導的細胞內降解途徑，在維持肝臟代謝穩定方面發揮著關鍵作用[14]。mTOR 為自噬的負調節劑，通過影響自噬體的形成來抑制自噬的發生[4]，在細胞處于饑餓狀態下，mTOR 活化被抑制，促進細胞自噬，以回收再利用細胞內的營養物質[15]。SIRT1 是去乙?；傅囊环N，能夠直接脫酸化自噬相關蛋白，如Atg5，Atg7和Atg8，進而促進自噬體的形成。SIRT1 通過抑制mTOR 信號途徑來增強自噬。mTOR 是一個抑制自噬的關鍵蛋白，SIRT1 通過抑制其活性從而促進自噬的啟動[16]。位于細胞核中的LC3B-Ⅰ被SIRT1 脫乙?；?，去乙?；腖C3B-Ⅰ輸出到細胞質中被轉化為LC3B-Ⅱ，LC3B-Ⅱ是自噬膜形成的標志[17]。p62 是與LC3B-Ⅱ結合后被降解的產物，當自噬體與溶酶體之間的融合受到抑制時，會觀察到p62 的積累[18]。既往研究表明，NAFLD患者和動物模型研究證實了自噬障礙與肝臟脂質沉積密切相關[19]。本研究結果發現，NAFLD 小鼠肝臟組織中，SIRT1、LC3B-Ⅱ蛋白表達水平明顯下降，p-mTOR、p62 水平顯著升高。TSF 干預后，各蛋白表達水平均明顯恢復，提示TSF 可能通過增強自噬改善肝細胞脂肪累積及肝臟破壞程度。

本研究表明TSF 可通過調節自噬來減少NAFLD 小鼠的肝臟脂肪積累，改善肝功能異常。盡管如此，TSF 調控自噬改善NAFLD 的確切機制尚待進一步研究，其發揮主要治療作用的藥效物質基礎還尚不明確，需要進行更系統的研究，揭示其療效機制，為TSF的臨床應用提供研究依據。