熒光可視化技術在食品分析中的應用進展

王小燕,劉 崢,郭容婷,丁智遠,呂奕菊,孔翔飛

(桂林理工大學 化學與生物工程學院 電磁化學功能物質廣西區重點實驗室,桂林 541004)

隨著生活水平的提高,食品污染和食品添加劑過量添加等問題引起人們的廣泛關注。食品分析中常用的檢測方法主要有電化學分析法[1]、高效液相色譜法[2]、紫外-可見吸收光譜法[3]、熒光分光光度法[4]、比色法[5]、色譜-質譜聯用法[6-7]、側向層析免疫測定法[8]等。但在進行現場檢測時,這些方法往往存在檢測成本高、檢測時間長、專業化程度高、儀器攜帶不方便等問題[9]。熒光可視化技術是借助紫外光激發熒光團,通過肉眼觀察熒光的產生、猝滅或強弱變化來實現對待測物進行可視化檢測的方法,具有成本低、操作簡單、易攜帶、靈敏度高等優點[10],已應用于食品分析領域?；谠摷夹g開發的常見傳感器有比率、紙基和分子印跡等熒光傳感器,這些熒光傳感器使用的發光物質主要有量子點[碳量子點(CQDs)、硫量子點(SQDs)、Cd Te量子點、生物質量子點(BCQDs)]、有機熒光物質、金屬熒光納米團簇(NCs)等。當加入待測物后,待測物與熒光傳感器通過不同傳感機制[熒光共振能量轉移(FRET)[11]、內濾效應(IFE)[12]、光誘導電子轉移(PET)[13]、聚集性誘導猝滅(ACQ)[14]、聚集誘導發射(AIE)[15]、分子內電荷轉移(ICT)[16]、金屬-配體電荷轉移(MLCT)[17-18]、扭曲分子內電荷轉移(TICT)[19]、電子能量轉移(EET)[20]和激發態分子內質子轉移(ESPT)[21]]相互作用,使發光物質熒光信號改變,以此實現待測物的快速定性、定量檢測[22]。但是,國內介紹熒光可視化技術在食品分析中應用的綜述較少,因此本工作綜述了常見的熒光可視化傳感器以及熒光可視化傳感機制的分類和判定,然后基于發光物質種類對熒光可視化技術在食品分析中的應用進行了歸納總結,最后對熒光可視化技術在食品分析中的應用前景進行了展望。

1 常見的熒光可視化傳感器

比率熒光傳感器是在同一傳感基質中摻雜兩種或兩種以上對待測物具有不同響應的發光物質,然后利用兩個或多個發射峰強度比與待測物含量的定量關系檢測待測物。該傳感器可以有效消除背景干擾,提高肉眼識別力,達到定性檢測的目的,具有檢測范圍寬、檢出限低和靈敏度高等優點[23]。紙基熒光傳感器在過去十年中得到了廣泛應用,該傳感器可與智能手機一起進行協同檢測,具有成本低、化學試劑耗費少、操作簡單、分析快速、能肉眼定量檢測等優點[24-25]。紙基熒光傳感器一般采用紙片作基底,通過直接沉積、噴墨印刷、蠟印、絲網印刷等方法將納米傳感材料結合到紙基上[26],其中選用的紙片主要為沃特曼濾紙(No.1,41,42)、色譜紙、光澤紙、石蕊試紙、吸墨紙、純纖維素紙和金屬化紙等[27]。沃特曼濾紙和色譜紙因具有高透氣性、生物相容性和生物降解性,獨特的孔徑和厚度,較強的毛細作用,能有效存儲化學試劑等特點而被廣泛應用于食品安全、臨床診斷、環保等領域[28-29]。分子印跡熒光傳感器是一種能選擇識別待測物位點的聚合物材料,具有檢測快速、選擇性高、成本低,酸、堿、熱穩定性好,易于制備等優點[30]。當存在待測物時,分子印跡熒光傳感器與待測物作用,肉眼可觀察到體系熒光隨著待測物含量的變化而變化,已應用于待測物的現場實時可視化檢測。

2 熒光可視化傳感機制的分類和判定

目前熒光可視化傳感機制主要包括FRET、IFE、PET、AIE、ACQ、ICT、MLCT、TICT、EET 和ESPT 等。FRET 是通過長程偶極-偶極相互作用將激發態供體(通常為熒光團)能量轉移到近端基態受體(供體和受體間的距離為1～10 nm,且供體的發射光譜與受體的吸收光譜重疊[31]),從而導致熒光團熒光猝滅,加入待測物后熒光恢復。IFE 是通過發光物質或待測物對激發光或發射光的吸收來實現檢測的[32],傳感機制相較FRET 更加直接和靈活。典型的PET 是由受體、間隔基團和熒光基團相連構成的超分子體系,當光誘導電子從激發態的受體分子轉移到熒光基團時,熒光基團熒光猝滅,如果上述過程被待測物抑制或者阻斷,熒光基團熒光恢復[33-34]。AIE過程是發光物質在溶液中的分子運動被限制,形成聚集體或團簇體,從而產生熒光增強的現象[35],如果發光物質在稀溶液中表現出強烈的熒光但在濃溶液或固態物質中表現出發光性能下降甚至熒光完全消失的現象時,該過程則被稱為ACQ[36]。

推斷熒光可視化傳感機制的方法各有不同。對于FRET 和IFE 傳感機制,常采用紫外-可見吸收光譜、紅外光譜和Zeta電位等表征方式進行聯合判定[37]。其中,紫外-可見吸收光譜用于測量待測物加入前后體系吸收峰的位置和強度,如果體系吸收峰的位置和強度均未發生變化,說明熒光探針和待測物未形成配合物,初步排除FRET 傳感機制。然后,采用Zeta電位儀測量待測物和熒光探針的表面電荷,如果二者表面電荷相同,則說明待測物和熒光探針間產生了靜電排斥作用,相互作用距離增大(大于10 nm),進一步排除FRET 傳感機制。此時,如果待測物的紫外-可見吸收峰與熒光探針的激發/發射光譜重疊,則上述過程的作用機制為IFE[38]。如果待測物加入前后體系吸收峰的位置、強度和Zeta電位所測表面電荷的結果與上述表述相反,則說明該過程的作用機制屬于FRET。還可通過熒光壽命或者Stern-Volmer方程等進一步判定FRET 作用過程屬于靜態猝滅或動態猝滅。待測物加入后,熒光探針壽命變短,猝滅常數隨著溫度的升高而增大時,屬于動態猝滅過程;熒光壽命不變,猝滅常數隨著溫度的升高而減小時,屬于靜態猝滅過程。對于PET 傳感機制的判定,首先需確定待測物是良好的電子受體,然后測量熒光探針、待測物以及二者混合體系的紫外-可見吸收光譜,如果體系的吸收光譜位置、形狀與待測物的基本一致且長波長處未形成新吸收峰,則表明熒光探針和待測物間沒有發生復雜的電荷轉移,可以排除PET 機制[39-40],否則即是PET 機制;利用漫反射定律(Kubelka-Munk函數)和電化學法可以判定PET 機制是否為熒光猝滅的主要原因,當待測物的峰電位位于熒光探針的價帶和導帶之間時,表明熒光傳感機制屬于PET[41]。對于ACQ 機制,主要通過透射電子顯微鏡(TEM)和動態光散射法(DLS)來判定,當待測物加入后,熒光探針粒子粒徑顯著增加且分散狀態變差時,可判定為ACQ 機制[42-43]。除了采用上述測試手段,還可以采用理論模型,如密度泛函理論(DFT)、時間相關密度泛函理論(TDDFT)或量子化學等推斷熒光傳感機制,如YANG 等[44]利用量子化學揭示了羅丹明B和7-羥基香豆素相互作用機制屬于PET。

3 熒光可視化技術在食品分析中的應用

3.1 量子點

量子點是一種粒徑為2～20 nm 的球形或準球形低維材料,具有熒光壽命長、抗光解性優異、發射帶窄且連續可調等特性[45],已被廣泛用于谷類、薯類、動物性食物、豆類及其制品、蔬菜、水果等食品中殘留農獸藥、抗生素、食品添加劑、重金屬離子等的檢測。

3.1.1 普通量子點

普通量子點主要是指利用化學原料合成的量子點,包括CQDs、SQDs、Cd Te量子點等以及在上述量子點基礎上制備的摻雜量子點。ZOU 等[46]利用N-CQDs制備了紙基熒光傳感器,用于檢測高粱和大米中的Hg2＋。在N-CQDs中加入Hg2＋后,二者在動、靜態猝滅機制的聯合作用下,紙基芯片的猝滅面積發生肉眼可見的改變,從而實現Hg2＋的肉眼檢測。該紙基熒光傳感器的檢測范圍為1～50μmol·L－1,檢出限為0.8 μmol·L－1。HU等[47]采用CQDs和金納米粒子制備了無熒光現象的Au＠CQDs,基于FRET 機制,將Au＠CQDs加至含有三聚氰胺的牛奶中時,三聚氰胺中的胺基與金納米粒子結合,CQDs黃綠色熒光恢復。采用智能手機提取發射熒光的RGB 值,可以建立與三聚氰胺含量的定量關系。該方法所得三聚氰胺的回收率為102.75%～105.64%,準確度結果與高效液相色譜法的基本一致。YE 等[48]采用Cd Te量子點制備了比率熒光紙基傳感器,在加入氟喹諾酮類抗生素(FQs)后,基于PET 機制,Cd Te量子點熒光顏色由黃綠色變為藍色,利用智能手機提取待測物加入前后發射熒光的RGB值并建立與FQs含量的定量關系,可以實現牛奶、飲用水和魚塘水中FQs的現場快速檢測,回收率為96.00%～104.00%。QIU等[49]以硫脲和檸檬酸為原料,采用檸檬酸裂解法制備了氮、硫共摻雜石墨烯量子點(N,S-GQDs),構建了基于Cd Te量子點和N,S-GQDs的比率熒光傳感器,用于檢測魚類樣品中的孔雀石綠(MG)。加入不同含量的MG 后,紫外燈照射下體系熒光顏色會從紅色變為藍色,由此實現樣品中MG 的肉眼觀測。CHU 等[50]將紙基熒光傳感器和3D 打印技術聯合開發了一種檢測殺蟲劑福美雙的傳感平臺,該傳感平臺將Cd Te量子點嵌入二氧化硅納米顆粒(SiO2NPs)中作為內部參考物,發藍色熒光的CQDs(bCQDs)作為信號單元共價連接到SiO2NPs的外表面。由于FRET 機制,bCQDs的熒光被金納米粒子猝滅,加入福美雙之后,金納米粒子發生聚集,bCQDs熒光恢復,紫外燈照射下其熒光顏色由淺藍色、粉色變為藍色,該方法已成功用于自來水、蘋果皮和牛奶等加標樣品的分析,福美雙回收率為95%～110%。

3.1.2 生物質量子點

BCQDs是以生物質原料(如橙汁、頭發、甘蔗渣、核桃殼、雞蛋、稻渣、西瓜皮和豬骨等)制備的納米熒光碳點,具有易制備、易功能化、光穩定性良好、細胞毒性低和生物相容性優異等特點。在BCQDs中摻雜其他元素,可改變BCQDs發射峰的位置、強度以及對待測物識別的靈敏度和選擇性等,常見的摻雜元素有N、S、P、B、Se、Si、F、I等,摻雜方式有單原子、雙原子、三原子摻雜等[51]。

ARKIN 等[52]以廢棄櫻桃番茄莖為原料,色氨酸為氮源,合成了由N-BCQDs和Eu 組成的NBCQDs＠Eu比率熒光傳感器,用于定性可視化檢測牛奶和蜂蜜中的土霉素(OTC)。加入OTC 后,基于IFE 機制,中性環境下體系熒光會從藍色變為紫色,堿性環境下體系熒光會從無色變為綠色。HU 等[53]以韭菜為原料制備了N,S-BCQDs,可作為高效“關-開”型熒光探針用于白菜中有機磷農藥敵敵畏(Ops-DDPV)的檢測。乙酰膽堿酯酶/膽堿氧化酶(AChE/Ch Ox)級聯酶促作用產生的過氧化氫會導致N,S-BCQDs的藍色熒光猝滅,而Ops-DDPV 對ACh E活性有抑制作用,加入Ops-DDPV后,N,S-BCQDs的藍色熒光恢復,據此建立了定性可視化檢測Ops-DDPV 的方法。KORAH 等[54]以姜黃為前驅體合成了一種新型的發藍色熒光的BCQDs,可通過IFE機制熒光猝滅檢測自來水和牛奶中的四環素,氫鍵增強作用檢測自來水和牛奶中的氟喹諾酮類抗生素,以此達到可視化檢測目的。

LIAN 等[55]以烏桑樹葉為原料制備的BCQDs和分子印跡聚合物(MIPs)開發了一種分子印跡比率熒光傳感器(BCQDs＠MIPs),并成功用于貝類組織中岡田酸的檢測。加入岡田酸后,基于PET 機制,BCQDs＠MIPs的熒光會在亮粉色和黃綠色間變化。FAN 等[56]以奶粉和氯化鐵為原料,制備了Fe-BCQDs,用于維生素C片中的抗環血酸(AA)的檢測。Fe-BCQDs能夠催化3,3′,5,5′-四甲基聯苯胺(TMB)生成TMB 氧化產物(ox TMB),而ox TMB會通過IFE 機制猝滅Fe-BCQDs的藍色熒光。加入AA 后,AA 與ox TMB 作用,Fe-BCQDs藍色熒光恢復。黃楊等[57]以雞爪外皮為原料采用一步水熱法合成了BCQDs,加入Fe3＋后,Fe3＋會與BCQDs表面的羥基、羧基等形成鐵-羥基或鐵-羧基復合物,從而導致BCQDs的綠色熒光猝滅。當在上述體系中加入亞硝酸鹽時,Fe3＋被還原成Fe2＋,BCQDs熒光恢復,該方法可用于腌臘肉制品中亞硝酸鹽含量的快速測定。

3.2 有機熒光物質

有機熒光探針具有優異的生物相容性、結構可調性和相對較低的毒性等特點[58-59],可用于食品中Fe3＋、Zn2＋、Cu2＋、Hg2＋、Al3＋、Pb2＋、HSO3－/SO32－、F－、Cl O－/HCl O、CN－、硫化氫、肼、甲醛、苯硫醇等的快速檢測[60]。THANAYUPONG等[61]通過薗頭(Sonogashira)偶聯和克腦文格爾(Knoevenagel)反應合成了一種新型的發藍色熒光的含有二氰基乙烯基的苯乙炔衍生物。該物質可作為一種開啟式探針,與氰化物通過ICT 機制作用,使其藍色熒光顯著增強,從而實現水和木薯淀粉中氰化物的高選擇和高靈敏檢測。SUN 等[62]合成一種含2-(苯并噻唑)-4-(3-羥基-4-甲基苯基)亞氨基苯酚(BHMH)的雙功能熒光探針BHMH-Cu2＋/Fe3＋配合物,該配合物對草甘膦表現出了良好的靈敏度和選擇性。通過智能手機提取發射熒光的RGB值,可實現自來水、江水、土壤以及牛奶、大豆、玉米、綠豆、小米和大米等中草甘膦的快速檢測,回收率為98.1%～116.3%。YANG 等[63]制備了一種雙功能有機熒光探針2-(1 H-苯并咪唑-2-基)苯胺(BMA)紙基傳感器,用于火腿腸、蘿卜條、魚罐頭和咸菜中的亞硝酸鹽的檢測。加入亞硝酸鹽后,BMA可以與亞硝酸鹽反應形成具有六元環結構的化合物,體系熒光由天藍色變為無色。

3.3 金屬熒光納米團簇

NCs一般為具有較小粒徑的熒光納米顆粒,由幾個金屬原子組成,是介于微觀和宏觀之間的介觀尺度聚集體,如金納米簇(Au NCs)、銀納米簇(Au NCs)、銅納米簇(Cu NCs)等NCs,具有亞納米尺寸、易于合成以及良好的生物相容性、光穩定性等特點[64]。

KHAN 等[65]以Au NCs、L-脯氨酸(Lp)和牛血清白蛋白(BSA)合成了藍色熒光Lp-Au NCs和紅色熒光BSA-Au NCs,將兩種物質按照一定的比例組成混合體系。同時加入黃曲霉毒素B1(AFB1)和玉米赤霉烯酮(ZEN)后,基于FRET 機制,體系熒光顏色會從藍色變為紅色,該方法可同時半定量檢測玉米中的這兩種毒素,且檢測結果與標準方法酶聯免疫吸附測定法(ELISA)的基本一致。WANG等[66]通過一鍋法合成了3-巰基丙酸(MPA)功能化的Cu NCs熒光探針(Cu2＋＠MPA-Cu NCs),Cu2＋＠MPA-Cu NCs聚集體在365 nm 紫外光照射下會發出強烈的粉紅色熒光,加入S2－后,S2－與Cu2＋結合,Cu2＋＠MPA-Cu NCs聚集態被破壞,導致其熒光猝滅?；贏IE 機制,上述探針可實現味精、食用鹽、白砂糖和冰糖中的S2－的檢測。SHI等[67]開發了一種適配體(apt)修飾的Cu＠Au NCs比率熒光紙基傳感器apt-Cu＠Au NCs,apt-Cu＠Au NCs在不含Hg2＋溶液中分散性能較好,在含Hg2＋溶液中會與Hg2＋結合形成胸苷-Hg-胸苷結構,基于FRET 機制,上述過程體系熒光顏色會由藍色變成紅色。將上述傳感器用于紫菜中Hg2＋的定量檢測,Hg2＋回收率為107.33%～114.00%,相對標準偏差不大于3.56%。LI 等[68]開發了一種基于Cu NCs的熒光可視化傳感器,并用智能手機輔助檢測,成功用于牛奶中姜黃素(CCM)和次氯酸鹽的檢測?；贗FE機制,Cu NCs的藍色熒光被CCM 猝滅。在加入次氯酸鹽后,CCM 的酚基和甲氧基被氧化成醌,Cu NCs的熒光恢復。CCM 和Cl O－的檢測范圍分別是0.5～5μmol·L－1和5～150μmol·L－1,檢出限分別為0.06μmol·L－1和0.5μmol·L－1。CHEN 等[69]合成了一種風味酶(Fla)穩定的Au NCs(Fla-Au NCs,平均粒徑為1.37 nm),用于蘋果、梨、橙子、白菜、馬鈴薯和番茄中農藥西維因的檢測,由于MLCT、AIE 和靜電引力等多種機制的共同作用,體系藍色熒光明顯增強。

4 結語和展望

紙基傳感器能通過簡單的浸泡、打印等方法將納米材料打印在濾紙上,制備的試紙易于攜帶和進行肉眼觀察,同時還可利用智能手機提取RGB 值進行更精確檢測,因此該傳感器在現場可視化快速定量檢測中的應用前景較好。BCQDs可以使用綠色、環保的廢棄生物質作原料,且合成過程簡單、成本低,但是該量子點在紙基熒光傳感器制備以及食品分析中的應用不多,后續可開拓這些方面的研究;同時,BCQDs的形貌、尺寸和功能易受原料以及溫度、時間等合成條件的影響,建立一個可靠、重現性好的制備方法是未來的研究重點。相較AuCNs和AgCNs,CuCNs價格更加低廉,但是它在食品分析中的應用不多,建議相關研究人員增加該方面的應用。傳感機制的判定對于熒光可視化技術的推廣應用助力很大,但是目前關于判定方法的系統性研究還比較缺乏,建議先通過紫外-可見吸收光譜等表征方法進行大致的判斷和預測,再通過理論計算進一步驗證,相關的系統性研究工作需盡快開展。