何宇城,俞錳錳,韋艷雪,王 超,付 晨,陳豪羿,梅高翔,辛振麒,馬國榮,袁建鋒
(1. 浙江師范大學行知學院,浙江金華 321004;2. 浙江蘭溪錦榮生物科技股份有限公司,浙江金華 321004)
桃膠別名桃樹膠。桃、李等薔薇科植物的樹干受外力割傷,或者被微生物感染后,傷口處分泌的膠質物即為桃膠。新鮮的桃膠顏色為淺紅色或者淺黃色,呈半透明狀。桃膠干燥后質地由膠質變為質地堅硬的固體,使用工具切割,可見切割面有光澤感[1]。桃膠中含有大量多糖,主要組成有鼠李糖、半乳糖、α - 葡萄糖醛酸等[2],中醫認為其具備益氣、活血、止渴之功效,也能降低血脂[3]。隨著研究的不斷深入,桃膠目前在化妝品、印染、化工、食品、醫藥等領域已有應用[4]。
多糖的提取主要有溶劑提取法[5]、微波輔助提取法[6]、酶輔助提取法[7]、雙水相提取法[8]、超聲波輔助提取法[9]、超濾法[10]、高壓脈沖法[11]等方法。超聲波提取法是利用超聲波產生的機械振動,破碎桃膠的細胞壁和細胞膜,在短時間內使其多糖擴散到溶劑中。故采用超聲波輔助提取桃膠多糖,通過響應面法確定其最佳工藝條件,以期為桃膠多糖提取產業化提供一定理論參考。
桃膠,購自浙江金華磐安;3,5 -二硝基水楊酸、氫氧化鈉、苯酚、亞硫酸氫鈉、葡萄糖,國藥集團化學試劑有限公司提供。
JY92-ⅡN 超聲波細胞粉碎儀弄,寧波新芝生物科技股份有限公司產品;料理機,美的集團股份有限公司產品;Eppendorf centrifuge5810 R 型離心機,德國艾本德股份公司產品。
準確稱取100 mg 葡萄糖,加蒸餾水溶解,轉移至100 mL 容量瓶中,定容至刻度;將其稀釋,得到葡萄糖標準溶液,配置質量濃度分別為0.02,0.04,0.06,0.08,0.10 mg/mL 梯度的葡萄糖待測液。再加入DNS 試劑5 mL,100 ℃下水浴反應5 min,冷卻后定容至25 mL,用分光光度計測定波長540 nm 處的吸光度。
用料理機將購自浙江金華磐安的桃膠打成粉末,用80 目篩過濾,得到桃膠粉末。
用蒸餾水按一定的料液比溶解桃膠粉末,在不同的超聲功率下提取相應時間,離心得到上清液,加入6 mol/L 鹽酸,沸水浴條件下加熱1 h。冷卻后加蒸餾水稀釋,并且加入氫氧化鈉稀釋成中性,得桃膠多糖稀釋液。
為獲得桃膠多糖提取的最佳工藝,考查不同料液 比(1 ∶100,1 ∶150,1 ∶200,1 ∶250,1 ∶300)、超聲功率(125,150,175,200,225 W)、提取時間(10,15,20,25,30 min) 對桃膠多糖得率的影響。
選取單因素試驗中3 個最優水平,構建三因素三水平響應面,優化桃膠多糖提取工藝。
運用上述DNS 法,將提取液重復測定3 次,取3 次測得吸光度的平均值,然后代入線性方程計算出多糖的含量。
葡萄糖質量濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標,得到方程Y=9.39X-0.037 6,R2=0.999。結果表明當葡萄糖質量濃度為0.02~0.10 mg/mL 時,與吸光度線性關系較好。
葡萄糖標準曲線見圖1。
圖1 葡萄糖標準曲線
2.2.1 料液比對桃膠多糖得率的影響
料液比對桃膠多糖得率的影響見圖2。
圖2 料液比對桃膠多糖得率的影響
在提取功率200 W,提取時間15 min 的條件下,由圖2 可知,逐步增加料液比,桃膠多糖得率不斷提高,在料液比為1∶200 時,桃膠多糖得率最高。進一步增加料液比,桃膠多糖得率下降??赡苁沁^多的溶劑分散了超聲波對桃膠粉末的作用[12]。試驗選取料液比1∶150,1∶200,1∶250(g∶mL) 進行響應面優化分析。
2.2.2 超聲功率對桃膠多糖得率的影響
超聲功率對桃膠多糖得率的影響見圖3。
圖3 超聲功率對桃膠多糖得率的影響
在料液比1∶200,提取時間15 min 的條件下,由圖3 可知,超聲功率為125~175 W,多糖得率隨著超聲功率的增加而增加,功率大于175 W 時,多糖得率略有下降。超聲波可使細胞壁破壞,利于多糖溶出,但當超聲功率過高時,可能會引起局部溫度過高,導致多糖結構被破壞,得率下降[13]。試驗選取超聲功率150,175,200 W 進行響應面優化分析。
2.2.3 提取時間對桃膠多糖得率的影響
提取時間對桃膠多糖收率的影響見圖4。
圖4 提取時間對桃膠多糖收率的影響
在料液比1∶200,提取功率200 W 的條件下,由圖4 可知,在10~20 min 時,多糖得率隨著時間的增加而增加,20 min 后得率下降??赡苁且驗檫^長時間的超聲會破壞多糖分子結構,導致得率下降。試驗選取提取時間15,20,25 min 進行響應面優化分析。
Box-behnken 中心組合試驗因素與水平設計見表1,響應面試驗設計與方差分析見表2。
表1 Box-behnken 中心組合試驗因素與水平設計
表2 響應面試驗設計與方差分析
對表3 試驗數據進行分析,得到二次多項回歸模型為:
二次模型的方差分析見表3。
表3 二次模型的方差分析
此模型的p值<0.01,具有顯著性差異,說明該多項式數學模型對試驗擬合度較好。A2對得率有顯著性影響,C2對得率有極顯著影響。桃膠多糖得率受提取時間的影響最大,其次是料液比,最后是提取功率。
料液比和超聲功率對多糖得率的影響見圖5,料液比和超聲時間對多糖得率的影響見圖6,超聲功率和超聲時間對多糖得率的影響見圖7。
圖5 料液比和超聲功率對多糖得率的影響
圖6 料液比和超聲時間對多糖得率的影響
圖7 超聲功率和超聲時間對多糖得率的影響
通過Design Expert 8.0.6 軟件對響應面數據進行優化,得到最佳工藝為料液比1∶203.5,超聲功率181 W,時間20.35 min 時,理論得率可達到83.97%。
為檢驗響應面模型是否擬合較好,設置料液比1∶203.5,超聲功率181 W,超聲時間20.35 min 試驗組,進行3 次平行試驗,測得桃膠多糖得率為83.94%,與理論值較為接近,說明響應面模型擬合度較高。
以桃膠粉碎后的粉末為原料,通過3 個不同的因素(料液比、超聲功率和超聲時間) 來進行響應面法的優化,最終得到了桃膠多糖提取工藝參數為料液比1∶203.5,超聲功率181 W,超聲時間20.35 min時,實際桃膠多糖得率可達到83.94%,為桃膠多糖提取工藝提供理論基礎。