綿羊EST-SSR分子標記的鑒定及特異性分析

馬小梅，宋亞倩，羅瑞明

（寧夏大學食品與葡萄酒學院 銀川 750021）

中國的綿羊飼養歷史悠久，綿羊存欄數、品種遺傳資源較多。據《國家畜禽遺傳資源品種名錄（2021年版）》統計，我國綿羊品種或遺傳資源共有89 個，其中包括44 個地方綿羊品種，32 個培育綿羊品種，13 個引進綿羊品種。整體上來說，中國的綿羊主要有藏系綿羊、蒙古系綿羊以及哈薩克系綿羊[1]。藏綿羊作為我國西北地區特有的羊種，主要分布在西藏、青海、四川、甘肅等地區，由于常年生活在平均海拔3 000 m 以上的高寒、低氧地區，造就了藏綿羊耐寒、耐粗飼、抗病等優點[2]。灘羊是寧夏特色優勢畜種，是一種極其珍貴的動物資源，特定的自然生態環境賦予了灘羊肉鮮香、細嫩，不膻、不腥等優良品質[3-4]。新疆細毛羊屬毛、肉兼用細毛羊，產于新疆鞏乃斯種羊場，是新中國成立以來育成的第一個毛、肉兼用細毛羊品種[5]。

灘羊（Tan sheep）系蒙古羊的一個分支，屬于短脂尾綿羊，是中國珍貴的綿羊品種。其肉質細嫩鮮美，營養豐富，風味獨特且含脂率低，不膻不腥，是公認的優質羊肉之一。與其它羊肉相比，灘羊肉具有獨特風味與口感；且營養成分結構明顯優于其它品種羊肉。

近年來，以其它品種羊肉冒充灘羊肉的現象屢屢發生。這不僅侵犯了消費者權益，更阻礙了灘羊肉產業的穩定健康發展。研發快速、準確鑒別灘羊及其它品種綿羊肉的分子標記技術，是灘羊產業發展亟需解決的技術問題。

表達序列標簽（Expressed sequence tags，EST）是分子標記的重要工具，基于EST 序列開發的SSR 稱為表達序列標簽SSR（EST-SSR）。ESTSSR 作為表達基因的一部分，不僅可以對功能基因進行定位[6-7]，而且可以將不同種群或同一種群基因的遺傳多態性檢測出來，甚至能夠在近源物種中實現跨種擴增[8]。迄今為止，雖然已有很多從植物的EST 數據庫中篩選微衛星標記的報道，如葡萄[9]、茄子[10]、蘆筍[11]、胡蘿卜[12]、小麥[13]和松樹[14]等，但是基于EST-SSR 標記方法對于動物物種的研究較少，目前僅發現在鯉魚、草魚、黃鱔、鲇魚、牛、蝦等和昆蟲的報道。

本文旨在利用現有綿羊EST 數據庫資源開發EST-SSR 標記，并對開發的EST-SSR 的分布情況、堿基組成、堿基類型等方面進行生物信息分析。采用PCR 技術和毛細管電泳技術，篩選出對寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊有效區分的特異性引物?？茖W、準確地判斷不同綿羊肉的品種，對于不同綿羊的種質資源保護以及科學開發利用均具有重要指導意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗所用純種寧夏灘羊的肝臟來自大夏牧場（寧夏鹽池縣），純種藏綿羊和純種新疆細毛羊的肝臟來自天祝藏族自治縣鑫榮盛生態養殖有限公司（甘肅省武威市）。

Taq Plus DNA 聚合酶、10X PCR 緩沖液（含Mg2+）、dNTP（10 mmol/L）、引物、DNA 快速抽提試劑盒，生工生物；6×DNA 負載染料、DNA 階梯混合、POP-7TM聚合物、二甲酰胺，Thermo Fisher 公司。

1.2 儀器與設備

PCR 儀、測序儀，美國ABI 公司；凝膠成像儀，上海復日科技有限公司；BP 系列精密單道可調移液器，加拿大BBI 公司；UV-Vis Spectrophotometer，Merinton 公司；TLTERTEK BERTHOLD 微量核酸蛋白濃度測定儀，美國Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備 采用典型集群的簡單隨機抽樣方法進行采樣，采樣過程中注意避免采集雜交群體及外源性污染。其中寧夏灘羊、藏綿羊和新疆細毛羊各20 只，分別多點取樣，每只綿羊肝臟樣本為25 g，采樣完成后將樣本分裝標記，共計60 個樣本。

1.3.2 DNA 提取 采用動物基因組DNA 快速抽提試劑盒[15]提取DNA，通過核酸蛋白濃度測定儀和1%瓊脂糖凝膠電泳評估DNA 質量。加入50～100 μL 的TE 緩沖液溶解DNA 沉淀，-20 ℃保存DNA 樣品。

1.3.3 綿羊EST-SSR 的查找與篩選 根據NCBI系統中的綿羊EST 數據庫，應用SSR Finder 軟件在線查EST-SSR 位點，查找中使用的標準是[16]：單、二、三、四及五核苷酸的重復次數分別為7，7，6，5，4；同時包括復合型微衛星序列。此外，引物序列含量一般表現為上、下游引物的含量不能相差太大[17]。

1.3.4 EST-SSR 引物設計合成 使用Primer 3.0進行引物設計[18]，原則如下：引物長度控制在18～24 bp 之間；GC 含量在40%～60%；熔解溫度（Tm）控制在50～65 ℃；產物的長度控制在100～350 bp之間[19]；兩條引物的長度差別不應該太大[20]。引物之間盡量避免發夾結構或二聚體；引物之間應是低互補性或無互補性[21]。隨機篩選出100 條ESTSSR 引物，以3 個綿羊的肝臟DNA 為模板進行PCR 擴增。

1.3.5 EST-SSR 擴增和毛細管電泳 PCR 反應體系和反應條件分別見表1 和表2。

表1 聚合酶鏈式反應體系Table 1 PCR reaction system

表2 聚合酶鏈式反應條件Table 2 The programs of PCR

對獲得的EST-SSR 引物進行熒光標記和PCR 擴增，擴增產物經毛細管電泳檢測和STR 分型。使用基因組分析儀分析數據，導出每對引物的峰圖文件，篩選出有一定多態性且有明顯特征峰的微衛星標記引物[22]。

1.3.6 特異性引物的有效性與適用性檢驗 對篩選出的特異性引物進行有效性與適用性驗證。選用3 個純種綿羊品種各5 只，分別對其肝臟與肌肉進行多點采樣，每個樣本25 g，采后將不同品種分裝標記，共計30 個樣本。寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊的肝臟及肌肉分別標記為L1-5、L6-10、L11-15 和M1-5、M6-10 以及M11-15。提取3 個綿羊品種的不同部位DNA，用特異性引物進行PCR 擴增和毛細管電泳分析。

2 結果與分析

2.1 DNA 質量評估

A260/A280 用于評估核酸樣品的純度[23]：純凈的樣品比值應大于1.80[24]。試驗中樣本所提取的全基因組DNA 的質量濃度為（128.4±0.01）ng/μL，總量為50 μL，樣本A260/A280 比值為1.84±0.01，且凝膠電泳條帶清晰無拖尾（圖1），表明DNA 質量良好。

圖1 DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測結果Fig.1 The electrophoresis results of DNA

2.2 EST-SSR 位點分布結果

使用MISA 檢測序列中的EST-SSR 位點，結果得出：共計3 193 個有效EST-SSR 位點序列，長度為150～3 628 bp 不等。通過表3 得出單、二、三、四、五核苷酸和復合SSR 重復序列個數和占比分別為834（26.12%），14（0.44%），7（0.22%），1（0.03%），3（0.09%）個和2 334（73.10%）個，結果說明綿羊EST-SSR 的優勢基序重復類型是復合堿基；然而相比其它重復類型，單核苷酸占比相對較高。

表3 綿羊基因組EST-SSR 重復單元分布特征Table 3 Distribution characteristics of EST-SSR repeat units in sheep genome

由圖2 可得，c 和c* 類型即復合SSR 的占比最高。觀察分析2 334 個復合SSR 重復序列發現，復合SSR 重復序列具有更大的SSR 長度[25]，而且種類豐富，要遠遠高于非復合SSR。主要組合形式包括（CC）6（C）12*、（A）12（AA）6*、（C）12（CC）6*、（AA）6（A）12*和（A）13（AA）6*等。此結果進一步驗證了在EST-SSR 位點重復類型規律上，多數物種中還是以復合SSR 類型為主[22]，且不同的搜索標準和數據庫的完整性都會對EST-SSR 的出現頻率產生影響[26-27]。

圖2 綿羊基因組EST-SSR 重復單元分布圖Fig.2 Distribution map of the EST-SSR repeat units in the sheep genome

2.3 3 種綿羊EST-SSR 引物的篩選

經PCR 擴增及毛細管電泳檢測結果發現，50對引物中，只有4 對EST-SSR 引物成功擴增出穩定條帶，4 對引物詳細信息見表4。

表4 EST-SSR 引物信息Table 4 Primer information for EST-SSR

2.4 3 種綿羊EST-SSR 引物的特異性分析

通過對3 個品種綿羊的50 個EST-SSR 引物的峰圖進行分析，有3 對引物能夠產生高度特異性擴增片段，可以用于區分3 個綿羊肉品種。圖3、圖4、圖5 分別是使用引物p2105.1：248-559、p2025.1：896-1059 和p2104.1：704-1015 的寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊的毛細管電泳結果。

2.4.1 寧夏灘羊引物特異性分析 由圖3 可知，使用引物p2105.1：248-559 的寧夏灘羊毛細管電泳結果有兩個明顯的特征峰，特征值大小為106.27 bp 和124.32 bp；而新疆細毛羊和藏綿羊均只有一個特征峰，特征數據大小分別為123.28 bp和123.32 bp。由此可見：p2105.1：248-559 對寧夏灘羊源性肉特異性良好，可將灘羊與另外兩綿羊品種進行區分。

圖3 綿羊基因組p2105.1：248-559 位點SSR 電泳圖Fig.3 The electrophoresis results of SSR of p2105.1：248-559 site of sheep genomic

2.4.2 新疆細毛羊引物特異性分析 由圖4 可知，使用引物p2025.1：896-1059 的新疆細毛羊的特征值大小為158.77 bp；寧夏灘羊的特征數據大小為120.27 bp；藏綿羊的特征數據大小為129.42 bp 和124.13 bp。由此可見：p2025.1：896-1059 可將新疆細毛羊與寧夏灘羊和藏綿羊進行區分。

圖4 綿羊基因組p2025.1：896-1059 位點SSR 電泳圖Fig.4 The electrophoresis results of SSR of p2025.1：896-1059 site of sheep genomic

2.4.3 藏綿羊引物特異性分析 由圖5 可知，使用引物p2104.1：704-1015 的藏綿羊只有一個特征峰，特征值大小為153.06 bp；對新疆細毛羊和寧夏灘羊均有兩個特征峰，特征值大小分別為116.64，134.31 bp 和116.63，132.92 bp。由此可見：p2104.1：704-1015 對藏綿羊源性肉特異性良好，可以對藏綿羊與另外兩綿羊進行區分。

圖5 綿羊基因組p2104.1：704-1051 位點SSR 電泳圖Fig.5 The electrophoresis results of SSR of p2104.1：704-1051 site of sheep genomic

2.5 特異性引物的有效性與適用性檢驗結果

2.5.1 DNA 質量評估 對3 種綿羊的肝臟和肌肉DNA 進行質量評估，結果顯示：肌肉DNA 的A260/A280 比值為1.80 ± 0.04，肝臟DNA 的A260/A280 比值為1.82±0.03，表明DNA 質量良好。所提取肌肉DNA 的質量濃度為（125.6±0.02）ng/μL，總量50 μL；肝臟DNA 的質量濃度為（128.9±0.01）ng/μL，總量50 μL。由此可知，在相同體積下，肝臟DNA 的質量濃度更高。本試驗結果與前人研究結果一致[28-29]。

2.5.2 EST-SSR 3 條引物的毛細管電泳檢測結果

2.5.2.1 寧夏灘羊 將提取的寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊肝臟DNA 用引物p2105.1：248-559分別擴增后，進行毛細管電泳檢測。結果顯示，引物p2105.1：248-559 對寧夏灘羊有兩個特征峰，特征值均在106 bp 和114 bp 上下波動；對于藏綿羊和新疆細毛羊都只有一個特征峰，特征值在120 bp 上下波動，充分說明引物p2105.1：248-559能夠檢測到其中L1～5，共5 只綿羊為寧夏灘羊（表5）。將提取的寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊肌肉DNA 用引物p2105.1：248-559 分別擴增并進行毛細管電泳檢測，發現引物p2105.1：248-559同樣對寧夏灘羊有兩個特征峰，對于藏綿羊和新疆細毛羊都只有一個特征峰，且對于3 種綿羊肉的肌肉鑒別結果的特征值合理，能夠成功檢測到其中M1～5，共5 只綿羊為寧夏灘羊（表5）；驗證結果與試驗前的形態學標記一致。

2.5.2.2 新疆細毛羊 將提取的新疆細毛羊、寧夏灘羊和藏綿羊肝臟DNA 用引物p2025.1：896-1059 分別擴增后，進行毛細管電泳檢測。結果顯示，引物p2025.1：896-1059 對新疆細毛羊的特征值在158 bp 的范圍內，對于寧夏灘羊的特征值在120.27 bp；藏綿羊的特征值在129 bp 和124 bp 范圍內，特征值有明顯差異，因此p2025.1：896-1059引物能夠檢測到其中L6～10，共5 只綿羊為新疆細毛羊（表5）。將提取的寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊肌肉DNA 用引物p2025.1：896-1059 分別擴增并進行毛細管電泳檢測。結果發現，引物p2025.1：896-1059 對于新疆細毛羊、寧夏灘羊和藏綿羊的肌肉DNA 的特征值波動合理，說明p2025.1：896-1059 熒光引物有良好的鑒別范圍，能夠檢測到其中M6～10，共5 只綿羊為新疆細毛羊（表5）；試驗結果與實驗前的形態學標記結果一致。

2.5.2.3 藏綿羊 將提取的藏綿羊、寧夏灘羊和新疆細毛羊肝臟DNA 用引物p2104.1：704-1015分別擴增后，進行毛細管電泳檢測。毛細管電泳的峰圖顯示，引物p2104.1：704-1015 對于藏綿羊只有一個特征峰，特征值均在153 bp 的范圍內上下波動；對于寧夏灘羊和新疆細毛羊都有兩個特征峰，兩個特征峰的特征值都在116 bp 和132 bp 范圍內浮動，提示引物p2104.1：704-1015 能夠檢測到其中L11～15，共5 只綿羊為藏綿羊（表5）。將提取的寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊肌肉DNA 用引物p2104.1：704-1015 分別擴增后，進行毛細管電泳檢測，發現引物p2104.1：704-1015 對于肌肉樣本的峰的數量和特征值均與肝臟樣本一致，可以得出熒光引物p2104.1：704-1015 能夠檢測到M11～15 共5 只綿羊為藏綿羊（表5）；此驗證結果與試驗前的形態學標記結果一致。

表5 EST-SSR 引物驗證結果Table 5 EST-SSR primer verification results

此驗證結果表明通過EST-SSR 方法獲得的熒光引物p2105.1：248-559、p2025.1：896-105 和p2104.1：704-1015 分別對寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊特異性良好，可對3 種綿羊肉品種進行區分。

3 結論

本文采用Rapid Animal Genomic DNA Isolation Kit 試劑盒提取寧夏灘羊、新疆細毛羊和藏綿羊的肝臟DNA，并以EST 數據庫為基礎，通過SSR Finder 軟件及MISA 技術檢測序列中的EST-SSR 位點。Fast QC 可視化SSR 位點結果顯示，共計3 193 個有效EST-SSR 位點序列，其中復合SSR 重復序列（73.10%）>單核苷酸（26.12%）>二核苷酸（0.44%）>三核苷酸（0.22%）>五核苷酸（0.09%）>四核苷酸（0.03%），說明綿羊EST-SSR的優勢序列重復類型為復合SSR 重復序列。使用毛細管電泳檢測SSR 分型，發現引物p2105.1：248-559、p2104.1：704-1015 和p2104.1：704-1015 分別對3 種綿羊肉特異性良好，能夠實現對此3 種綿羊肉的有效區分。將EST-SSR 標記技術應用于寧夏灘羊肉、新疆細毛羊肉和藏綿羊肉的鑒別中，成功驗證了3 條引物的有效性與適用性，這對于地方綿羊品種遺傳資源的開發利用、品種鑒別及豐富分子標記類型具有重要的意義。