CRISPR/Cas系統的核酸檢測及其在食品安全快速檢測中的應用

翟百強，程 楠，王洪濤，徐瑗聰

（1 北京工業大學環境與生命學部 北京 100024 2 河南省鐵路食品安全管理工程技術研究中心 鄭州 450052 3 中國農業大學食品科學與營養工程學院 北京 100083）

食品安全關乎民生，快速、精準的檢測能夠為食品安全事件提供有效的科學預警。生物傳感器檢測技術能夠將未知靶標有效轉化成可測量的信號，成為食品安全快速檢測領域的佼佼者。核酸傳感器依托核酸中間體承載信號的識別、放大和轉導的作用，在食源性致病菌、農藥殘留、重金屬檢測、生物摻偽等[1-3]檢測中表現優異，有效縮短了檢測時間，提高了檢測特異性及靈敏度。2020年諾貝爾化學獎揭曉后，CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR；CRISPR-associated protein，Cas）系統因優異的基因編輯能力、獨特的靶點識別方式、極高的酶活力等特性廣為人知，在核酸檢測領域表現出巨大的應用價值[4-6]。由其構建的核酸傳感器也成為食品安全快速檢測平臺的研究熱點。本文就基于CRISPR/Cas系統的研究進行綜述，分析不同CRISPR/Cas 系統結合核酸技術在不同靶標檢測中的應用情況，展望CRISPR/Cas 核酸傳感器在食品安全快速檢測領域的未來研究方向，以促進其在食品安全檢測中的進一步應用。

1 CRISPR/Cas 系統概述

CRISPR-Cas 系統即成簇規律間隔的短回文重復序列以及CRISPR 相關蛋白系統，是一種獲得性免疫系統，存在于眾多古細菌和細菌中[7]。根據系統依賴的Cas 蛋白的不同可以分成2 大類[8]：第1 類Cas 蛋白是多亞基蛋白復合物，發揮活性需要依靠多個效應蛋白協同作用，第2 類Cas 蛋白是獨立蛋白，發揮活性僅依靠單一效應蛋白。根據Cas 蛋白的基因結構及重復間隔序列結構不同可以分為6 類（Ⅰ～Ⅵ型），其中Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型屬于第1 類系統，Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型屬于第2 類系統[8-9]。CRISPR/Cas系統的作用機制包括3 個階段：獲取、表達和干擾。首先將外源基因整合到CRISPR 基因座2 個重復序列中間，獲得間隔序列；其次基因座轉錄成前體crRNA，隨后加工為成熟crRNA（CRISPR RNA）；最后crRNA 與Cas 蛋白復合，發揮核酸酶活性對外源基因進行切割[9]?；贑RISPR/Cas系統的檢測技術則是依據作用機制，根據檢測靶標序列設計向導RNA（Singleguide RNA，sgRNA），當其與特異性靶標識別配對后，激活Cas 蛋白的切割活性，通過切割產物的分析實現靶標的檢測。目前的研究主要集中在Cas9、Cas12、Cas13 以及Cas14 這4 種蛋白（圖1），其中基于Cas9 的檢測側重于sgRNA 的設計，通過特異性識別靶序列實現多重檢測；基于Cas12、Cas13 及Cas14 的檢測則重點依賴Cas 蛋白激活后的切割活性。

圖1 CRISPR/Cas9（a）、Cas12（b）、Cas13（c）及Cas14（d）基本組成及作用原理圖Fig.1 Fundamental components and mechanism of CRISPR/Cas99（a），Cas12（b），Cas13（c），and Cas14（d）systems

1.1 CRISPR-Cas9

Cas9 蛋白是最為典型的2 類Ⅱ型CRISPR 系統效應蛋白，是RNA 引導和dsDNA（Doublestrand DNA）靶向的核酸內切酶，含有HNH 和RuvC 2 個核酸酶結構域，其中HNH 只有1 個核酸酶區域，RuvC 含有3 段核酸酶區域[10]。CRISPRCas9 系統需要Cas9、crRNA 和tracrRNA（Transactivating RNA）協同發揮作用，其中crRNA 與tracrRNA 合并設計形成一條sgRNA，當Cas9 與crRNA 部分結合后，能夠識別含有PAM（Protospacer adjacent motif）位點（5'-NGG）的靶標dsDNA，crRNA 與靶標dsDNA 中的互補鏈形成RNADNA 異源雙鏈結構，隨后Cas9 的兩個核酸酶結構域活性被激活，進而切斷靶標dsDNA[11]。后有研究發現單獨添加小段PAMmer 序列，與ssDNA 靶標形成含有PAM 序列的部分dsDNA 后，Cas9 依然能夠發揮切割活性對ssDNA 靶標進行切割[12]。此外研究通過對Cas9 的HNH 和RuvC 結構域進行突變，得到沒有活性的dCas9（Nuclease-deactivated Cas9）蛋白，雖能夠識別靶標dsDNA，但是沒有核酸酶切割活性[13]。

1.2 CRISPR-Cas12

Cas12 蛋白屬于2 類Ⅴ型CRISPR 系統效應蛋白，也是RNA 引導和DNA 靶向的核酸內切酶，只含有RuvC 核酸酶結構域[8]。CRISPR-Cas12 系統中，Cas12 蛋白能夠在crRNA 的引導下識別含有PAM 位點（5'-TTTN）的靶標dsDNA，或者識別不需要PAM 位點的ssDNA（Single-strand DNA）靶標序列，形成三鏈或者雙鏈復合體，隨后激活RuvC 的核酸內切酶活性，切割特異性靶標dsDNA或者靶標ssDNA（也稱作cis 切割），同時還激活了反式切割活性，能夠切割其它非特異性ssDNA（也稱作trans 切割）。其中反式切割活性的激活需要一個必備條件，就是要求靶標模板序列中至少有15 個堿基與crRNA 互補。由于dsDNA 靶標中非互補鏈有助于提升“互補鏈/crRNA/Cas12 蛋白”的穩定性，因此dsDNA 靶標激活的反式切割能力要遠遠高于ssDNA 靶標。Cas12 蛋白的家族成員包括Cas12a～Cas12f，但研究多集中在Cas12a 和Cas12b。Cas12a 又稱為Cpf1 蛋白，Cas12b 又稱為C2c1 蛋白，兩者的區別在于前者的crRNA 成熟不需要tracrRNA 參與，而后者需要，但是兩者都同時具備核酸內切酶活性和反式切割活性[14-16]。

1.3 CRISPR-Cas13

Cas13 蛋白屬于2 類Ⅵ型CRISPR 系統效應蛋白，是RNA 引導和RNA 靶向的核酸內切酶，含有兩個HEPN 核酸酶結構域[8]。CRISPR-Cas13 系統中，Cas13 蛋白本身能夠對crRNA 的成熟進行加工處理，不需要tracrRNA 參與，隨后在crRNA的引導下識別含有PFS（protospacer-flanking sequence）位點的（3'-A 或U 或C）的RNA，形成雙鏈RNA 復合物促使HEPN1 和HEPN2 兩個結構域相互靠近，從而激活HEPN 核酸酶的核酸內切酶活性，切割特異性靶標RNA，同時還激活了反式切割活性，能夠非特異性切割其它非靶標RNA[17-18]。Cas13 蛋白的家族成員包括Cas13a～Cas13d，其中關于Cas13a 的研究較多，不同的Cas13 對切割探針具有不同的偏好性。Cas13a 又稱為C2c2 蛋白，通過對核酸酶區域的殘基突變可得到沒有核酸酶活性dCas13a，能夠結合靶標RNA 卻沒有切割性能[19]。

1.4 CRISPR-Cas14

Cas14 蛋白屬于2 類Ⅴ型CRISPR 系統效應蛋白，是RNA 引導和ssDNA 靶向的核酸內切酶，含有RuvC 核酸酶結構域。CRISPR-Cas14 系統與Cas9 系統相似，需要Cas 蛋白、crRNA 和tracr-RNA 協同發揮作用，不同的是Cas14 的識別不需要PAM 位點。其切割特性與Cas12 相似，與Cas13的區別在于識別的靶標不同，Cas14 專一識別靶標ssDNA 后激活RuvC 核酸酶的核酸內切酶活性，切割特異性靶標ssDNA，同時還激活了反式切割活性，能夠非特異性切割其它非靶標ssDNA[20]。由于CRISPR/Cas14 系統對crRNA 和ssDNA 靶標的錯配容忍度很低，成功突破了ssDNA 靶標精準識別的短板，成為了CRISPR 系統巨大的進步。其家族成員包括Cas14a～Cas14c，是目前最小的第2 類CRISPR 效應蛋白[21]。后有研究報道，Cas14 是屬于Cas12f 的亞類，其中Cas14a 屬于Cas12f1，Cas14b屬于Cas12f2，而Cas14c 屬于Cas12f3[22]。

2 CRISPR/Cas 系統與核酸擴增技術的結合應用

不同的CRISPR/Cas 系統識別不同類型的靶標，在檢測過程中直接識別則存在靶標濃度低，基質干擾等問題，一般需要通過核酸擴增技術對靶標進行放大，再利用產物作為新的靶標與CRISPR/Cas 系統結合建立相應的核酸傳感器檢測平臺。不同的核酸擴增技術能夠生產不同類型的靶標產物，兩者之間的組合能夠充分發揮CRISPR/Cas系統的檢測功能，目前已組裝成多種類型的CRISPR/Cas 核酸檢測平臺并廣泛應用于各大檢測領域。各平臺之間的差異和改進多集中在5 個方面：操作步驟（擴增和檢測兩步反應的合并）、特異性（堿基突變的識別）、過程污染（閉管反應避免交叉污染）、檢測通量（單重升級到多重檢測）以及結果輸出（實現裸眼可視化）。核酸擴增技術根據溫度依賴程度可以分為恒溫擴增和變溫擴增，根據產物類型可以分為雙鏈產物擴增和單鏈產物擴增，其中能夠生成雙鏈產物的恒溫擴增技術應用較多，典型代表是重組聚合酶擴增技術（Recombinase polymerase amplification，RPA），有經典的SHERLOCK、DETECTR 等檢測平臺。

2.1 CRISPR/Cas 系統結合NASBA

NASBACC（NASBA/CRISPR cleavage）檢測平臺是CRISPR/Cas 系統與核酸擴增技術的首次結合應用。核酸序列依賴擴增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）是以RNA為模板，依賴AMV 反轉錄酶、Rnase H 酶和T7RNA 聚合酶的等溫擴增技術，其中間產物為DNA 雙鏈。NASBACC 方法中，以寨卡病毒的RNA為靶標進行NASBA 擴增，中間產物DNA 轉錄得到RNA，然后通過小立足點置換激活傳感器上的顏色反應，通過黃色和紫色的區分實現基因分型。方法的巧妙之處在于，CRISPR/Cas9 系統中cr-RNA 選取的PAM 序列恰好是兩種寨卡病毒的基因差異片段。美國寨卡病毒通過NASBA 擴增后能夠得到含有“CGG”的dsDNA 產物，與crRNA 進行和互補配對，并激活Cas9 蛋白的切割活性，將ds-DNA 切斷，隨后轉錄只能得到小段RNA，無法激發后續反應而呈現出黃色結果。非洲寨卡病毒存在堿基突變，擴增后得到的是含有“CAG”的dsDNA 產物，由于PAM 序列的突變，無法激活Cas9的切割活性，此時dsDNA 能夠轉錄得到完整的RNA，通過小立足點置換反應激活后續的生化反應呈現紫色結果，從而實現對寨卡病毒的精準分型鑒定[23]。

2.2 CRISPR/Cas 系統結合RPA

SHERLOCK（Specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）[24]和DETECTR（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter）[14]是CRISPR/Cas 系統結合RPA 擴增技術的2 個經典平臺。RPA 是以DNA 為模板，依賴重組聚合酶、單鏈結合蛋白和鏈置換DNA 聚合酶的等溫擴增技術，其擴增產物是DNA 雙鏈。

張鋒團隊建立的SHERLOCK 平臺，是基于CRISPR/Cas13a 與RPA 進行結合，整體包括2 個步驟。先由RPA 擴增生成dsDNA 產物，由于Cas13a 識別的是RNA 靶標，因此需要對dsDNA產物進行轉錄得到RNA 產物，隨后與crRNA 結合并激活Cas13a 的反式切割活性，切割熒光淬滅的RNA 探針，通過熒光的變化實現了寨卡病毒和登革病毒的區別檢測、致病菌的檢測、人類基因組分型以及單堿基突變檢測等。如果靶標是RNA，則需要先進行反轉錄再完成RPA 擴增[24]。不同的Cas13 蛋白對切割探針具有不同的偏好性，該團隊基于該特性進一步建立了SHERLOCKv2 平臺，通過 PsmCas13b、LwaCas13a、CcaCas13b 和 Cas12a對不同熒光探針的切割，實現了四重檢測，后續通過結合CRISPR 相關酶Csm6 進一步提升靈敏度，并應用于側流層析試紙條實現可視化檢測[25]。SHERLOCK 中RPA 擴增需要對靶標進行基因組提取，為了簡化核酸的提取步驟，該團隊再次建立HUDSON（Heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）平臺。通過加熱和化學處理釋放核酸，并使核糖核酸酶失活，從而實現寨卡病毒和革登熱病毒的SHERLOCK 快速檢測[26]。Arizti-Sanz 等[27]基于上述研究，組合SHERLOCK和HUDSON 建立了SHINE（SHERLOCK and HUDSON integration to navigate epidemics）平臺，通過體系優化實現了兩步法檢測的一體化，成功用于SARS-CoV-2 的免提取快速精準檢測。這一系列檢測平臺雖然具有良好的特異性和靈敏度，但是由于依賴的是Cas13 蛋白，因此需要增加反轉錄過程，一定程度上增加了操作的繁瑣性。

DETECTR 平臺[14]是基于CRISPR/Cas12a 與RPA 結合的原理建立，含有PAM 序列的dsDNA產物與crRNA 結合并激活Cas12a 的反式切割活性，切割熒光淬滅的ssDNA 探針，通過熒光的變化進行結果判定。利用“TTTC”PAM 序列后的6 個堿基差異，成功實現人乳頭瘤病毒HPV16 和HPV18 的精準快速檢測。隨后又基于Cas14a 建立了Cas14-DETECTR 平臺，用于人類眼球顏色基因HERC2 中單核苷酸多態性（Single nucleotide Polymorphism，SNP）的分型鑒定。由于Cas14a 識別的是ssDNA 靶標，反應中先由硫代磷酸化引物（只有一條引物進行標記）進行RPA 擴增生成單標記dsDNA 產物，隨后利用T7 核酸外切酶對沒有標記的鏈進行水解得到ssDNA 產物，隨后與crRNA 結合并激活Cas14a 的反式切割活性，對熒光淬滅的ssDNA 探針進行切割。鑒于CRISPR/Cas14 系統對crRNA 和ssDNA 靶標的錯配容忍度很低，能夠在沒有PAM 序列的條件下有效區分單堿基突變，該方法成功實現藍眼球和棕眼球的SNP 檢測，相比之下Cas12a 無法區分[20]。為了簡化反應流程，實現擴增和檢測一體化，Wang 等[28]合并DETECTR 建立了Cas12aVDet（Cas12a-based visual detection）平臺，將所有試劑整合在一個管中，Cas12a 附著在管壁上，RPA 擴增后通過離心將Cas12a 與之混合進而完成切割，最后通過藍光激發實現裸眼判定。該方法能夠在與DETECTR保持相同靈敏度的條件下，成功將檢測時間從2 h 縮短至0.5 h，并且全程閉管反應有效避免了交叉污染。

除了以上經典檢測平臺之外，還有許多關于CRISPR/Cas 系統和RPA 的聯合應用，大部分致力于特異性、靈敏度及便攜性上的升級。例如基于Cas12b 的CDetection（Cas12b-based DNA detection）用于HPV 檢測，靈敏度優于DETECTR。同時利用單堿基錯配的tgRNA（Tuned guide RNA）提高檢測特異性，實現血型SNP 分型檢測[29]。例如基于Cas12a 的AIOD-CRISPR（All-In-One Dual CRISPR-Cas12a）用于SARS-CoV-2 檢測，利用產物在上下游設計兩條crRNA，通過提升Cas12a 的利用率來提升檢測靈敏度[30]。例如基于Cas13a 的DESCS（Dual methylation sensitive restriction endonucleases coupling with an RPA -assisted CRISPR/Cas13a System）用于SEPT9 基因的甲基化檢測，利用限制性內切酶對甲基化位點的敏感性來調控后續RPA 反應，存在甲基化位點則限制性內切酶不產生切割，此時靶基因連續就能繼續發生RPA 擴增，進而完成Cas13a 的有效切割，結合側流層析試紙條實現可視化檢測[31]。

2.3 CRISPR/Cas 系統結合PCR

聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）是最為傳統的核酸擴增技術，屬于變溫擴增，產物為dsDNA。HOLMES（one-hour low-cost multipurpose highly efficient system）是基于CRISPR/Cas12a 與PCR 結合的經典平臺，較SHERLOCK 而言更適合DNA 靶標檢測。通過含有PAM 序列的dsDNA 產物與crRNA 結合并激活Cas12a 的反式切割活性，通過探針切割反應中熒光的變化完成。對于24nt crRNA 而言，HOLMES能夠識別PAM 序列以及PAM 后1～7 位堿基中單堿基突變，但是無法區分8～18 位堿基中的突變；對于16nt 和17nt crRNA 而言，HOLMES 能夠識別PAM 后1～16 位堿基中的突變。根據這一特性，在SNP 位點附近設計插入PAM 序列的PCR 引物，提升對SNP 檢測的特異性和靈敏度。HOLMES檢測平臺中，核酸擴增技術并不局限于PCR，還可以采用其它等溫擴增技術[32]。多重PCR 實現了單一檢測向高通量檢測的進階，Wang 等[33]將多重PCR 與CRISPR/Cas12a 結合建立了多重檢測平臺，針對不同的靶標設計不同的crRNA 序列，并將crRNA 分別裝載入不同的反應孔中，最后通過熒光的變化實現五重檢測。普通PCR 擴增耗時長達2 h 左右，快速PCR 能夠顯著縮短反應時間至5 min 內，Wang 等[34]將快速PCR 與CRISPR/Cas12a 結合建立了CRISPCR（CRISPR & rapid PCR in single capillary），將快速PCR 反應試劑與Cas12a 切割反應試劑分別置于反應管的上下兩部分，擴增后再混勻試劑進行切割，紫外照射后實現裸眼判定。該方法與Cas12aVDet 有異曲同工之妙，但能夠在10 min 內完成整體檢測，效率上更勝一籌。

2.4 CRISPR/Cas 系統結合LAMP

環介導等溫擴增技術（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）是經典的恒溫擴增技術，能在短時間內生成大量的dsDNA 產物，并且不依賴于熱循環儀器。為了簡化操作和避免反應交叉污染，同一團隊在HOLMES 的基礎上，將 CRISPR/Cas12b 和 LAMP 結合 建 立 了HOLMESv2 平臺，用于DNA 和RNA 靶標的檢測，并有效區分SNP。在LAMP 產物中選取含有PAM位點的片段作為檢測靶標，與crRNA 互補配對后激活Cas12a 的反式切割活性，根據熒光的變化進行結果分析。該檢測平臺中的核酸擴增技術并不局限于LAMP，也可以是PCR，或者是能夠生成單鏈產物的非對稱PCR。該方法還可以用于檢測基因甲基化，利用酸性亞硫酸鹽處理靶基因，甲基化的胞嘧啶保持不變，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，經過PCR 擴增后，只有甲基化的產物與cr-RNA 配對結合，產生熒光的變化[35]。結合LAMP 的其它應用也比較多，例如TB-QUICK 技術中，利用LAMP 進行核酸擴增，基于CRISPR/Cas12b 的cis切割活性實現結核桿菌的檢測[36]；CAL-LAMP（CRISPR/Cas12a assisted ligation-initiated LAMP）技術中，利用靶標連接發夾引物進而觸發LAMP反應，基于CRISPR/Cas12a 的trans 切割活性實現microRNA let-7a 的檢測[37]。雖然LAMP 應用十分廣泛，但是污染問題一直是限制該技術的最大弊端，為了避免交叉污染引起的假陽性，Qian 等[38]建立了尿嘧啶-LAMP，采用dUTP 代替dTTP，因此得到的是帶有dUTP 的擴增產物。同時發現Cas12bde PAM 序列可以由“TTTN”更改為“UUUN”，且不影響各種切割活性。因此結合尿嘧啶糖基化酶（UDG）、尿嘧啶-LAMP 和CRISPR/Cas12a建立了ULC（UDG-LAMP-CRISPR）檢測平臺。先用UDG 進行酶解消化，去除體系中殘存的dUTP擴增產物，再進行擴增和后續的切割反應，有效避免了反應污染問題。ULC 方法雖然有效，但是一定程度上增加了操作的復雜性，同樣是為了解決污染問題，Bao 等[39]基于CRISPR/Cas9 建立了CUTLAMP（Contamination-free loop-mediated isothermal amplification），通過在LAMP 內引物中添加PAM 序列，使得擴增產物中含有重復的PAM 序列，在Cas9/crRNA 的識別下能夠將產物進行切割降解，從而避免污染問題，有效杜絕假陽性反應。LAMP 技術是基于DNA 擴增的檢測方法，針對RNA 靶標，則需要通過反轉錄建立RT-LAMP，隨后將其與CRISPR/Cas12a 系統進行結合，建立了iSCAN（in vitrospecific CRISPR-based assay for nucleic acids detection）檢測平臺，搭載側流層析試紙條實現SARS-CoV-2 的可視化檢測[40]；建立了opvCRISPR（a one-pot visual reverse transcription（RT）-LAMP-CRISPR）檢測平臺，通過藍光激發實現SARS-CoV-2 的目視分析，具有良好的特異性靈敏度以及準確性[41]。

2.5 CRISPR/Cas 系統結合單鏈擴增技術

對于原始靶標信號來說，核酸擴增能夠有效放大靶標濃度，進而激活Cas 蛋白的活性。像RPA、LAMP 等這些擴增方法產物都是dsDNA，能夠直接與CRISPR 系統進行結合，但是還有許多核酸擴增技術的產物是ssDNA，與CRISPR 系統結合時具有一定的選擇性，例如CRISPR/Cas12 和CRISPR/Cas14 能夠識別單鏈靶標，則能直接結合應用，而CRISPR/Cas9 與之結合則需要添加互補鏈組裝成雙鏈靶標。

滾環擴增技術（Rolling circle amplification，RCA）是單鏈擴增中研究較多的一種方法，能夠在短時間內生產大量連續重復的ssDNA 產物。RACE（RCA-assisted CRISPR/Cas9 cleavage）檢測平臺是基于RCA 擴增和CRISPR/Cas9 系統聯合建立的，整體包括擴增和檢測兩個步驟。以靶標為引物，對含有PAM 序列的環模板進行RCA 擴增，產生含有大量重復靶標序列的單鏈產物；添加熒光淬滅的互補探針組裝成雙鏈產物，與crRNA 識別配對后激活Cas9 蛋白的切割活性，對雙鏈產物進行切割，導致探針斷裂而釋放熒光，通過熒光的變化實現對miR-21 的檢測[42]。Xu 等[43]利用適配體進行靶標轉導，基于RCA 和CRISPR/Cas12a 建立了針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的快速檢測方法。選擇菌體表面的A 蛋白和PBPa2 蛋白的適配體A 和B，其中適配體A 與磁珠偶連，適配體B用互補鏈進行封閉，當靶標菌體與兩條適配體混合時，通過磁分離能夠將“適配體A-菌體-適配體B”進行分離，剩下封閉鏈用于RCA 擴增，隨后與crRNA 互補后激活Cas12a 蛋白的反式切割活性，利用熒光變化完成檢測。Qing 等[44]利用RCA 作為一種轉導擴增，結合CRISPR/Cas12a 實現不同類型靶標的通用檢測。擴增部分，在環模板中設計特定的一段通用序列，根據靶標改變引物結合區序列，RCA 擴增后都能夠得到含有重復通用互補序列的產物，而通用互補序列能夠與crRNA 互補后激活Cas12a 蛋白的反式切割活性。檢測部分，連接氧化石墨烯電極，切割探針斷裂后，無法與亞甲基藍標記的報告探針互補配對，此時的報告探針被氧化石墨烯吸附，引起電信號升高，反之切割探針與報告探針形成雙鏈，無法被氧化石墨烯吸附，則電信號降低。通過RCA 的擴增轉導、Cas12a 的反式切割以及電化學傳感器的分析，實現了疾病相關核酸以及小分子的通用檢測。

除RCA 應用較多之外，還有一類依賴酶切反應的單鏈擴增技術，其中鏈置換擴增技術（Strand displacement amplification，SDA）是典型代表。Wang 等[45]利用SDA 結合CRISPR/Cas12a 實現了PNKP 的超靈敏檢測。發夾底物末端的磷酸基團在T4 PNKP 的作用下轉化成羥基，隨后發生SDA 反應，在鏈置換酶的作用下生成dsDNA，進而在切克內切酶的作用下生成ssDNA，兩者都是Cas12a/crRNA 的靶標，進而實現對熒光淬滅探針的切割。TITAC-Cas（Target-induced transcription amplification to trigger the trans-cleavage activity of Cas13a）檢測平臺是基于RNA 聚合酶介導的SDA和CRISPR/Cas13a 的聯合，用于堿性磷酸酶ALP的檢測。磷酸基團修飾的T7 啟動子序列與轉錄模板形成雙鏈底物，此時T7 啟動子序列能夠被外切酶水解。當存在ALP 時，磷酸基團被轉化成羥基從而使得T7 啟動子序列得到保護，進而在T7 RAN 聚合酶的作用下生成RNA，與crRNA 結合后激活Cas13a 的反式切割活性，通過切割探針熒光的變化完成檢測[46]。指數擴增技術（Exponential amplification reaction，EXPAR）是以單鏈靶標為引物進行擴增的SDA 反應。CAS-EXPAR（CRISPR/Cas9 triggered exponential amplification method）檢測平臺是基于EXPAR 和CRISPR/Cas9的聯合，與以往的不同是，該平臺是由CRISPR 激發EXPAR 擴增。ssDNA 靶標與PAMmer 小片段以及Cas9/sgRNA 混合后，形成含有PAM 序列的ss-DNA-dsDNA-Cas9/sgRNA 復合物，激活Cas9 蛋白活性對ssDNA 靶標進行切割，形成的產物能夠作為EXPAR 的引物觸發后續的擴增反應，對單核增生李斯特菌檢測具有良好的特異性和靈敏度[47]。Cas-G4EX（a CRISPR/Cas9 system mediated G4-EXPAR）檢測平臺是基于EXPAR、G4 核酸酶和CRISPR/Cas9 的聯合，用于ssRNA 和ssDNA 的方法學檢測。與CAS-EXPAR 前半部分原理相似，單鏈靶標與PAMmer 小片段和Cas9/sgRNA 形成復合物，切斷單鏈靶標為EXPAR 提供引物。EXPAR擴增模板中設計有兩個切割位點，因此一級產物能夠再次觸發二次擴增，終產物是富含鳥嘌呤的單鏈核酸，能夠在氯高鐵血紅素的作用下折疊成G 四面體，并呈現出類過氧化物酶活性，催化底物ABTS 發生顏色變化[48]。

2.6 CRISPR/Cas 系統結合核酸免擴增技術

對于低濃度靶標而言，核酸擴增雖能夠顯著放大原始信號，促進Cas 蛋白活性最大化，但也存在一些弊端，例如需要引物設計、需要擴增儀器、可能造成污染等等，因此許多免核酸擴增的技術與CRISPR/Cas 系統也開始進行結合應用。Choi等[49]利用雙納米金傳感器，結合CRISPR/Cas12a實現了癌癥核酸標志物的免擴增直接檢測。20 nm 金顆粒上連接有7 nm 長的ssDNA 熒光探針，60 nm 金顆粒上連接有9 nm 長的ssDNA 探針，兩條探針通過堿基配對組裝后，探針的熒光被60 nm 金顆粒淬滅。根據核酸靶標設計crRNA，不存在靶標則無法激活Cas12a 的活性。當單鏈核酸靶標存在時，能夠與crRNA/Cas12a 結合并激活切割活性，將探針的單鏈部分切斷，致使熒光恢復，20 nm 金顆粒則能進一步增強熒光，通過熒光的變化能實現對癌癥核酸標志物靶標的有效靈敏檢測。Li 等[50]利用金屬核酸酶的切割特性，結合CRISPR/Cas12a 實現重金屬的超靈敏檢測。根據鉛離子的金屬核酸酶的底物鏈設計crRNA，由于序列封閉使其無法與crRNA 結合，當鉛離子存在時，能夠切割底物鏈，釋放游離的ssDNA，進而與Cas12a/crRNA 結合并激活反式切割活性，通過熒光的變化實現鉛離子的直接檢測。Niu 等[51]利用適配體的生物功能，結合CRISPR/Cas12a 建立Molecular Radar（Random molecular aptamer-dependent CRISPR-assist reporter）檢測平臺，實現小分子物質的直接檢測檢測。根據小分子物質的適配體設計crRNA，適配體與Cas 12a/crRNA 結合并激活反式切割活性，熒光強度發生變化。當靶物質存在時，能夠與適配體結合引起適配體空間構象的變化，導致其無法與crRNA 結合，也就不存在反式切割。體系中靶物質濃度與熒光強度成反比，通過的熒光強度能夠實現小分子靶標的靈敏檢測。Sha 等[52]將CRISPR/Cas13a 和CRISPR/Cas14a 進行串聯，實現了microRNA 的超靈敏直接檢測。利用microRNA 作為靶標，與Cas13a/cr-RNA 結合并激活反式切割活性，將發夾底物的環單鏈進行切割，隨后在小立足點的作用下與Cas14a/crRNA 互補結合并激發反式切割活性，切割體系中熒光淬滅的探針，通過熒光的變化實現microRNA 的免擴增檢測。

3 CRISPR/Cas 核酸傳感器在食品快速檢測中的應用

核酸傳感器是利用核酸貫穿整體檢測，實現“靶標信號-核酸信號-化學信號” 的層層轉化，CRISPR/Cas 核酸傳感器則是在核酸傳感器的基礎上，將CRISPR/Cas 系統引入其中，完成整體檢測信號的識別、放大與轉導，顯著提高檢測靈敏度和特異性。目前，CRISPR/Cas 核酸傳感器已逐步應用于食品安全的快速檢測，例如食源性致病微生物、生物毒素、金屬離子、生物技術食品、肉類摻假以及非法添加等方面。

3.1 食源性致病菌的檢測

食源性致病菌引發的食品安全事件長居榜首。致病菌的CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測可分為兩大類（圖2）：第一，通過增菌后提取基因組，結合核酸擴增技術和Cas 蛋白的切割能力建立核酸傳感器檢測；第二，結合適配體實現致病菌向核酸的轉化，隨后直接或者間接與CRISPR/Cas 系統結合，建立相應的核酸傳感器，實現免培養免提取檢測。Peng 等[53]基于核酸擴增和CRISPR/Cas12a 建立了CRISPR/Cas-熒光傳感器，用于金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的檢測。通過基因組提取進行PCR 擴增，隨后將擴增產物與Cas12a/crRNA 結合，利用反式切割活性切割熒光淬滅探針，通過熒光強度的變化完成金黃色葡萄球菌的檢測，最低檢測限為103CFU/mL。Mukama 等[5]基于核酸擴增、CRISPR/Cas12a 和試紙條技術建立了CRISPR/Cas-側流層析傳感器，用于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的檢測。通過基因組提取進行LAMP 擴增，隨后將擴增產物與Cas12a/crRNA 結合，熒光淬滅探針作為連接體能夠將納米金固定在試紙條的檢測線上。當探針在反式切割活性作用下被切斷后，納米金則無法被固定在檢測線上，通過檢測線的有無實現了銅綠假單胞菌的定性檢測。Li 等[54]基于核酸擴增、CRISPR/Cas12a 和電化學技術建立了CRISPR/Cas-電化學傳感器，用于單核細胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的檢測。通過基因組提取進行RAA 擴增（原理與RPA 相同），隨后將擴增產物與Cas12a/crRNA 結合，利用反式切割活性將電極表面ssDNA 探針切斷引發電信號變化，實現了單核增生李斯特菌的檢測，最低檢測限為26 CFU/mL。Gootenberg 等[25]基于核酸擴增和CRISPR/Cas13 建立了CRISPR/Cas-雙重熒光傳感器，用于金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢測。通過基因組提取進行多重RPA 擴增，隨后將擴增產物反轉錄后與Cas13a/crRNA 和Cas13b/crRNA 結合，根據Cas13 蛋白對切割探針的偏好性，采取Cas13a 切割poly U 探針，Cas13b 切割poly A 探針，通過兩種熒光信號強度的變化，實現了金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的同時檢測。Shen 等[55]基于適配體、核酸擴增和CRISPR/Cas13a 建立了CRISPR/Cas-熒光傳感器，用于腸炎沙門氏菌（Salmonella Enteritidis）的免培養檢測。利用“適配體-T7 啟動區-引物結合區”設計發夾探針，探針中的適配體能夠有效識別靶標并與之結合，通過空間構象的變化釋放出引物區，結合引物后在DNA 聚合酶的作用下形成dsDNA，進而在T7 RNA 聚合酶的作用下生成ssRNA，與Cas13a/cr-RNA 結合后激活反式切割活性，通過熒光強度的變化實現腸炎沙門氏菌的檢測，最低檢測限為1 CFU/mL。Li 等[50]基于適配體和CRISPR/Cas12a 建立了CRISPR/Cas-熒光傳感器，用于鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）的免培養免擴增檢測。利用磁珠探針進行菌體捕獲，探針中的適配體與靶標結合后釋放互補鏈，而互補鏈能夠結合Cas12a/crRNA 激活反式切割活性，通過熒光強度的變化實現鮑曼不動桿菌的檢測，最低檢測限為3 CFU/mL。

圖2 食源性致病菌的CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測流程示意圖Fig.2 Schematic diagram of CRISPR/Cas nucleic acid biosensors detection process for foodborne pathogens

3.2 生物毒素的檢測

生物毒素是由動物、植物、微生物產生的有毒有害物質，引發食品安全事件較多的是微生物分泌的毒素。由于毒素屬于非核酸物質，所以在利用CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測時大多需要采用適配體進行核酸轉化（圖3）。Abnous 等[56]基于適配體、CRISPR/Cas12a、和納米金建立了CRISPR/Cas-比色傳感器，用于黃曲霉毒素M1（AFM1）的檢測。利用適配體和作為Cas12a/crRNA 的激活鏈，當AFM1存在時，適配體與靶標結合，則無法結合Cas12a/crRNA，此時Cas12a 沒有活性，納米金表面的ssDNA 引物和磷酸基團修飾的ssDNA 鎖式探針能夠在T4 連接酶和Phi29 DNA 聚合酶的作用下發生RCA 反應，生成大量的單鏈環繞在納米金表面。加入對硝基苯酚后，體系呈現出綠色。若是沒有AFM1，則適配體與Cas12a/crRNA 結合進而激活反式切割活性，能夠將納米金表面的ssDNA 引物和磷酸基團修飾的ssDNA 鎖式探針切斷，則無法發生后續的RCA 擴增，導致納米金表面裸露。加入對硝基苯酚后，在納米金的類過氧化物酶活性的催化下，對硝基苯酚被氧化成氨基苯酚，體系由綠色變為無色。通過顏色的變化實現AFM1 的超靈敏檢測，最低檢測限為0.05 ng/L。脂多糖（LPS）是一種內毒素，Wang 等[57]基于適配體、金屬核酸酶和CRISPR/Cas12a 建立了CRISPR/Cas-納米機器熒光傳感器，用于LPS 的檢測。將肼基標記ssDNA（ASI）和鎂離子金屬核酸酶的底物鏈（SS）修飾在磁珠（MB）表面，構建MB@SS/ASI復合物，醛基標記的ssDNA（ASII）中包含有金屬核酸酶的酶鏈，ASII 能夠通過C=N 鍵與ASI 相連，組裝為MB@SS/ASI/ASII 納米機器。隨后ASII的酶鏈部分與SS 互補配對組裝成完整的金屬核酸酶，在鎂離子的作用切斷SS，釋放出游離的單鏈靶標，ASII 則再次與新的SS 鏈互補并切割，往復循環至SS 全被切斷。通過磁分離將游離的單鏈靶標分離，與Cas12a/crRNA 結合進而激活反式切割活性，熒光信號顯著增強。在LPS 的檢測體系中，ASII 中含有適配體互補序列，與適配體形成雙鏈而封閉活性，當LPS 存在時，能夠與適配體結合釋放ASII，觸發后續反應，熒光增強。如果沒有LPS，則ASII 與適配體維持雙鏈狀態，進而無法觸發后續反應，沒有熒光信號。通過熒光信號強度的變化實現LPS 的檢測分析，最低檢測限為7.31 fg/mL。

圖3 生物毒素的CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測流程示意圖Fig.3 Schematic diagram of CRISPR/Cas nucleic acid biosensors detection process for biotoxin

3.3 金屬離子的檢測

食品安全風險檢測中提及的重金屬包含鉛、汞、銀、鎘、鉻等，目前的傳感器快檢技術主要是依基于金屬離子對應的核酸酶開展研究，實現重金屬離子向核酸信號的轉化，同樣，CRISPR/Cas 核酸傳感器也采取相同的策略（圖4）。Li 等[50]基于金屬核酸酶和CRISPR/Cas12a 建立了CRISPR/Cas-熒光傳感器，用于鉛離子的檢測。將鉛離子金屬核酸酶修飾在磁珠表面，并根據底物鏈設計crRNA，由于底物鏈互補且沒有PAM 序列，導致其無法激活Cas12a 的活性，熒光信號不變。當鉛離子存在時，切割底物鏈釋放出游離的ssDNA，進而與Cas12a/crRNA 結合并激活反式切割活性，熒光信號增強。通過熒光的變化實現鉛離子的檢測，最低檢測限為0.053 nmol/L。除重金屬外，食品中鈉離子作為核心營養素也備受關注，過多攝入也會影響人體健康。Xiong 等[58]基于金屬核酸酶和CRISPR/Cas12a 建立了CRISPR/Cas-熒光傳感器，用于鈉離子的檢測。將鈉離子金屬核酸酶底物鏈通過生物素-鏈霉親和素作用進行固定，沒有鈉離子時，底物鏈與酶鏈組裝為完整的金屬核酸酶，無法激活Cas12a 的活性，熒光信號不變。當鈉離子存在時，能夠切割底物鏈釋放出游離的ssDNA，進而與Cas12a/crRNA 結合并激活反式切割活性，熒光信號增強。通過熒光的變化實現鈉離子的檢測，最低檢測限為0.1 nmol/L。

圖4 金屬離子的CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測流程示意圖Fig.4 Schematic diagram of CRISPR/Cas nucleic acid biosensors detection process for metal ions

3.4 生物技術食品的檢測

生物技術食品一般是指基于生物技術得到的食品，目前大家比較熟識的主要是轉基因食品和基因編輯食品。采用CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測需要提取基因組、核酸擴增和Cas 蛋白切割3 個步驟（圖5）。Wu 等[59]基于核酸擴增、CRISPR/Cas12a 和自主便攜設備建立了CRISPR/Cas-便攜式熒光傳感器，用于轉基因大豆的檢測。通過基因組提取，針對35S 啟動子和大豆內源基因（Lectin）進行雙重LAMP 擴增，隨后將反應管倒置，擴增產物分別與兩個反應孔中的Cas12a/crRNA 結合，利用反式切割活性切割熒光淬滅探針，通過兩個孔的熒光變化完成轉基因大豆的檢測，最低檢測限為0.1%。Liu 等[60]基于核酸擴增和CRISPR/Cas12a建立了CRISPR/Cas-熒光傳感器，用于轉基因玉米的檢測。通過基因組提取進行RPA 擴增，隨后將擴增產物與Cas12a/crRNA 結合，在反式切割作用下通過熒光變化完成轉基因玉米中NOS 終止子和35S 啟動子的檢測，最低檢測限為10 拷貝。

圖5 生物技術食品的CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測流程示意圖Fig.5 Schematic diagram of CRISPR/Cas nucleic acid biosensors detection process for biotech foods

3.5 肉制品成分的檢測

肉制品中的肉類摻假問題是全球熱點，從我國的“掛羊頭賣狗肉”到國外的“馬肉事件”，以次充好、以假亂真的現象越來越常見。采用CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測同樣需要提取基因組、核酸擴增和Cas 蛋白切割3 個步驟（圖6）。Liu 等[60]基于核酸擴增和CRISPR/Cas12a 建立了CRISPR/Cas-熒光傳感器，用于肉制品中肉類成分的檢測。通過基因組提取進行RPA 擴增，隨后將擴增產物與Cas12a/crRNA 結合，在反式切割作用下通過熒光變化實現豬肉、牛肉和鴨肉的真實性檢測，最低檢測限分別為100 拷貝、10 拷貝和10 拷貝。

圖6 肉制品的CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測流程示意圖Fig.6 Schematic diagram of CRISPR/Cas nucleic acid biosensors detection process for meat product

3.6 非法添加物的檢測

一些食品安全事件是由于非法添加引起的，例如2008年的“三聚氰胺事件”，對中國奶業商業信譽造成了重創，就是因為生產者違法向奶粉中添加“非法添加物”三聚氰胺，導致眾多嬰幼兒出現腎結石甚至腎損傷。采用CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測則需要將非法添加物轉化成核酸進行分析（圖7）。Qiao 等[61]基于適配體和CRISPR/Cas12a 建立了兩個CRISPR/Cas-鎖式熒光傳感器，用于三聚氰胺的檢測，檢測準確性及靈敏度能夠與HPLC相匹配。第1 個傳感器中，利用一條互補鏈與適配體配對，當三聚氰胺與適配體結合后釋放互補鏈，與Cas12a/crRNA 結合并激活反式切割活性，通過熒光強度的變化完成檢測，最低檢測限為38 nmol/L；第2 個傳感器中，利用一條互補鏈與兩條適配體配對，后續反應一致，最低檢測限可達到0.24 μmol/L。

圖7 非法添加物的CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測流程示意圖Fig.7 Schematic diagram of CRISPR/Cas nucleic acid biosensors detection process for illegal additives

4 展望

CRISPR/Cas 核酸傳感器具有諸多優勢，但在未來的發展中仍具挑戰。第一，多重檢測發展有局限，雖然能夠通過不同的Cas 蛋白的選擇性或者分離反應能夠實現多重檢測，但是方法的通用性不強。尤其是針對食品安全風險檢測而言，能夠實現單一體系下的多重檢測更有研究意義，因此未來還應該在CRISPR/Cas 的多重分析上尋求新的突破，實現多重檢測可行化、簡便化。第二，核酸擴增技術雖能夠顯著放大原始信號，提升傳感器的靈敏度，但是擴增過程中容易引起交叉污染造成結果假陽性。針對這一弊端雖然也有多種技術進行改進，但是卻增加了操作上的繁瑣，未來還需要進一步探索出更有效的方法。第三，結果呈現方面有比色、熒光、電信號等，其中液相的比色分析、部分熒光分析和固相的試紙條分析能夠實現裸眼檢測，能夠應用在現場分析，但是電化學平臺則推廣受限，未來應該開發更多具有自主知識產權的小型便攜設備，擴大基礎科研走向現場應用。第四，食品安全檢測應用方面，雖然涵蓋了食源性致病菌、生物毒素等核酸和非核酸靶標，但是相關的研究并不多，并且大部分是以CRISPR/Cas12a 系統開展的研究，此外在農獸藥殘留檢測等關鍵風險因子方面仍沒有相關的研究，未來還需要進一步拓展CRISPR/Cas 的應用范疇。