枸杞多糖對DEACMP 大鼠海馬NF-κB 蛋白表達的影響

楊 平，張俊飛，肖紅科，胡小東，康向飛

（寧夏醫科大學總醫院急診科，寧夏 銀川 750000）

一氧化碳（carbon monoxide，CO）是一種有毒氣體，當機體吸入一定量后會出現中毒癥狀，嚴重者甚至危及生命[1]。據報道[2]，約有12%的患者治愈后會出現CO 中毒后遲發性腦?。╠elayed encephalophthy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP），表現為一系列神經、精神障礙等癥狀，給患者及家庭帶來嚴重的負擔，并會產生一系列社會危害，不利于社會治安。我地區為經濟相對落后的省份，冬季采暖期是DEACMP 的高發期。如何有效降低DEACMP 發生率，尋找臨床治療方法，提高其救治效果是臨床工作中的一項巨大挑戰。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）蛋白幾乎在所有細胞中均有表達[3]。研究表明[4，5]，NF-κB 蛋白在DEACMP 的發生中扮演重要角色，通過抑制NF-κB 表達可以達到治療DEACMP 作用。枸杞是我國傳統名貴中藥，現代醫學研究已表明其具有多種藥理作用和活性功效[6，7]。其中，枸杞多糖（Lyciumbarbarum polysaccharides，LBP）作為枸杞主要成分，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤及免疫調節等多種藥理作用[8]。由于LBP 可以自由通過并調節血腦屏障，因此其對神經損傷性疾病具有潛在的治療作用[9]?；诖?，本研究主要探討LBP 對DEACMP 大鼠海馬NF-κB 蛋白表達的影響，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF 級健康雄性Wistar 大鼠108 只，體重為200～240 g。實驗前大鼠在動物室內自由飲食飲水，光照12 h 明暗交替，保持室溫22 ℃～26 ℃，濕度50%～60%，適應性喂養1 周，實驗前隔夜禁食。本研究獲得了寧夏醫科大學總醫院倫理委員會批準（2019-518）。

1.2 實驗分組 采用隨機數字表法將大鼠分為空白組、DEACMP 組和LBP 組（40 mg/kg，連續灌胃治療）。對照組6 只，DEACMP 組和LBP 組各36 只。其中DEACMP 組和LBP 組根據時間點不同分為染毒第1、3、7、14、21 和28 天6 個亞組，每組6 只。

1.3 EACMP 大鼠模型制備 采用改良式腹腔注射CO 法建立DEACMP（首次注射99.99% CO 純品氣體120 ml/kg，后連續注射3 次，每次按照首次劑量的2/3，間隔4 h）?？瞻捉M大鼠用相同方法注射同等比例空氣。EACMP 造模成功判斷：初期從大鼠急性CO 中毒癥狀、動脈血COHb 濃度判斷，隨后利用Morris 水迷宮實驗檢測大鼠認知及記憶障礙，綜合判斷大鼠是否發生DEACMP。

1.4 Morris 水迷宮行為學實驗 ①定向航行實驗：Morris 水迷宮是由自動錄像、分析系統和圓形水池組成，其中圓形水池又分為4 個象限，命名為1、2、3、4。在1 象限固定有站臺，且站臺低于水面1 cm。大鼠隨機從2、3、4 象限入水，自動錄像系統記錄每只大鼠的逃避潛伏期。染毒前，連續訓練2 d，4 次/d，對各組大鼠在第1、3、7、14、21 和28 天時各進行4次實驗，4 次結果的平均值為當日大鼠的結果[10]；②空間探索實驗：第21 天撤除平臺，記錄各組大鼠在60 s 內經過1 象限的游泳時間[10]。

1.5 組織取材與指標檢測 實驗結束后對各組大鼠進行腹腔注射水合氯醛（300 mg/kg）麻醉動物，迅速經腹主動脈采血，所有血液均置于肝素抗凝采血管中，血樣經3500 r/min 離心5 min，收集上清血漿并按整體積分裝于凍存管中，血清樣本經液氮迅速冷凍后儲存于-80 ℃冰箱中待檢，血清樣本進行IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達水平檢測。腦組織取材固定后進行免疫組化研究，嚴格按照NF-κB 試劑（圣克魯斯生物技術公司，中國）說明書染色步驟進行，結果用半定量人工計數法進行分析，方法參照呂霞等[11]研究。

1.6 統計學方法 采用SPSS 21.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析方法；以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組炎性指標比較 DEACMP 組與LBP 組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達水平高于空白組，但LBP 組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達水平低于DEACMP 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 3 組炎性指標比較（）

表1 3 組炎性指標比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與DEACMP 組比較，#P＜0.05

2.2 3 組大鼠不同時間點平均潛伏期比較 3 組染毒前、染毒第1、7 天平均潛伏期比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；DEACMP 組與LBP 組染毒第14、21、28天平均潛伏期長于空白組，而LBP 組大鼠平均潛伏期短于DEACMP 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 3 組大鼠不同時間點平均潛伏期比較（，s）

表2 3 組大鼠不同時間點平均潛伏期比較（，s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與DEACMP 組比較，#P＜0.05

2.3 3 組大鼠不同時間點NF-κB 表達情況比較DEACMP組與LBP組染毒第1、7、14、21、28 天NF-κB 蛋白表達高于空白組，且LBP 組低于DEACMP 組，差異有統計學差異（P＜0.05），見表3。

表3 3 組大鼠不同時間點NF-κB 表達情況（）

表3 3 組大鼠不同時間點NF-κB 表達情況（）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與DEACMP 組比較，#P＜0.05

3 討論

CO 中毒后由于氧氣供應發生障礙，導致機體發生嚴重的缺氧，其中腦組織由于對缺氧耐受性最差往往會導致嚴重的缺氧性損傷，在這個過程中機體會發生一系列改變，包括血管內皮細胞損傷、血小板聚集和炎癥因子增加，進一步加重腦損傷[12]。TNF-α 和IL-6 等炎癥因子會在中樞神經系統（central nervous system，CNS）中大量聚集，從而激活相關信號通路，如NF-κB 信號通路，并進一步促進神經膠質細胞釋放大量炎性因子，形成惡性循環，加重CNS 的損傷[13]。有研究表明[13]，炎癥因子會增加血腦屏障的通透性，改變細胞內外微環境，進而加重神經元細胞的凋亡與壞死。另研究表明[13]，NF-κB 信號通路的激活會加重神經膠質細胞的損傷，并進一步促進如IL-6 和TNF-α 等炎癥因子的釋放，形成惡性循環。辜剛鳳等[14]研究表明，CO 中毒后可能通過上調NF-κB 表達，引起神經元細胞死亡、海馬突觸重塑，從而加重損傷損傷引起DEACMP，而給予藥物治療后可以通過降低NF-κB 表達，達到保護神經損傷作用。此外，在DEACMP 患者中，IL-6、IL-8 和IL-18 炎癥因子表達增加，而藥物治療后通過降低炎癥因子表達后可以有效改善患者神經損傷癥狀[15]。齊玲等[16]研究也表明，降低DEACMP 患者血清中炎癥因子IL-6、IL-10、IL-18、超敏C 反應蛋白和TNF-α 后可以有效改善患者的神經損傷。本研究結果顯示，DEACMP 組與LBP 組染毒第1、7、14、21、28 天NF-κB 蛋白表達高于空白組，且LBP 組低于DEACMP 組，差異有統計學差異（P＜0.05），表明CO 中毒后發生DEACMP 的過程中會導致海馬區NF-κB 蛋白的表達增加，同時血清中IL-1β、IL-6和TNF-α 表達水平也明顯升高，這表明炎癥因子與NF-κB 蛋白表達在DEACMP 發生中發揮了重要作用。

枸杞為茄科Solanaceae 枸杞屬落葉灌木植物，是我國傳統的名貴中藥材，我國有7 個種和2 個變種，其中寧夏枸杞分布最為廣泛，也是唯一被載入《中國藥典》的枸杞物種。枸杞主要有效成分為LBP，其在抗氧化、抗腫瘤、降血糖和血脂、免疫調節和神經保護方面具有很好的治療效果。研究表明[17]，LBP 可以通過減少機體氧自由基含量，從而達到保護缺氧后受損的神經元。腦部缺氧時可以抑制PI3K/Akt/GSK3β 信號通路促進神經細胞凋亡，而LBP 可以通過減少氧化應激和激活PI3K/Akt 信號通路，從而抑制神經細胞凋亡達到神經保護作用[18]。線粒體功能與形態在腦缺血缺氧損傷中發揮重要的作用，同時LBP 可通過降低氧自由基數量，緩解氧化應激損傷，抑制炎癥因子釋放而降低腦缺血缺氧性損傷，并抑制神經細胞中線粒體的凋亡來改善腦損傷。溫靜等[19]研究發現，LBP 可以減輕錳中毒小鼠神經損傷，縮短錳中毒小鼠的逃避潛伏期，增加穿環次數，提高學習記憶能力，通過增加海馬區SOD 活性，降低LPO 含量，促進海馬神經發生，從而影響小鼠的學習記憶能力，對神經毒性損傷具有很好的保護作用。也有研究表明[20]，LBP 可以降低放射性腦損傷海馬神經元的凋亡，并且降低海馬神經元中MDA含量，升高SOD 和GSH-Px 活性，通過PI3K/Akt/mTOR 信號通路和氧化應激有關通路降低神經細胞凋亡率，從而達到神經保護作用。本研究結果顯示，三組染毒前、染毒第1、7 天平均潛伏期比較，差異無統計學意義（P＞0.05）；DEACMP 組與LBP 組染毒第14、21、28 天平均潛伏期長于空白組，而LBP 組大鼠平均潛伏期短于DEACMP 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；且LBP 組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達水平低于DEACMP 組，差異有統計學意義（P＜0.05），提示給予LBP 治療后可以明顯降低大鼠海馬區NF-κB 蛋白的表達，此外也降低了大鼠的平均潛伏期；同時，LBP 可以降低DEACMP 大鼠血清中的炎癥因子表達情況，對DEACMP 大鼠的神經損傷具有很好的保護作用，其作用機制可能與調控NF-κB 信號通路有關，并通過降低炎癥因子的表達進一步減輕損傷有關。

綜上所述，LBP 對DEACMP 大鼠神經損傷具有較好的治療作用，其作用可能與調控NF-κB 信號通路有關。